ความแตกต่างที่สำคัญ – NGS vs Sanger Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) และ Sanger Sequencing เป็นเทคนิคการจัดลำดับนิวคลีโอไทด์สองประเภทที่พัฒนาขึ้นเมื่อเวลาผ่านไป วิธีการจัดลำดับ Sanger ใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นเวลาหลายปีและ NGS แทนที่เมื่อเร็ว ๆ นี้เนื่องจากข้อดีของมัน ความแตกต่างที่สำคัญระหว่าง NGS และ Sanger Sequencing คือ NGS ทำงานบนหลักการของการเรียงลำดับหลายล้านลำดับพร้อมกันอย่างรวดเร็วผ่านระบบการจัดลำดับ ในขณะที่ Sanger Sequencing ทำงานบนหลักการของการยุติสายโซ่เนื่องจากการรวมตัวกันของไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์ผ่านเอนไซม์ DNA polymerase ระหว่างการจำลองแบบดีเอ็นเอและการแยกชิ้นส่วนที่เป็นผลจากการแยกส่วนด้วยอิเล็กโตรโฟรีซิสของเส้นเลือดฝอย
ลำดับนิวคลีโอไทด์คืออะไร
ข้อมูลทางพันธุกรรมถูกเก็บไว้ในลำดับนิวคลีโอไทด์ของ DNA หรือ RNA ของสิ่งมีชีวิต กระบวนการกำหนดลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ถูกต้อง (โดยใช้เบสสี่ตัว) ในส่วนที่กำหนด (ในยีน กลุ่มของยีน โครโมโซม และจีโนมที่สมบูรณ์) เรียกว่าการจัดลำดับนิวคลีโอไทด์ เป็นสิ่งสำคัญมากในการศึกษาจีโนม การศึกษาทางนิติเวช ไวรัสวิทยา ระบบทางชีววิทยา การวินิจฉัยทางการแพทย์ เทคโนโลยีชีวภาพ และในด้านอื่น ๆ อีกมากมายในการวิเคราะห์โครงสร้างและหน้าที่ของยีน มีวิธีการจัดลำดับประเภทต่างๆ ที่พัฒนาโดยนักวิทยาศาสตร์ ในหมู่พวกเขา การจัดลำดับ Sanger ที่พัฒนาโดย Frederick Sanger ในปี 1977 ถูกใช้อย่างกว้างขวางและเป็นที่นิยมมาเป็นเวลานานจนกระทั่ง Next Generation Sequencing เข้ามาแทนที่
NGS คืออะไร
Next Generation Sequencing (NGS) เป็นคำที่ใช้อ้างถึงกระบวนการจัดลำดับปริมาณงานสูงสมัยใหม่ อธิบายถึงเทคโนโลยีการจัดลำดับสมัยใหม่ที่แตกต่างกันจำนวนหนึ่ง ซึ่งปฏิวัติการศึกษาจีโนมและอณูชีววิทยาเทคนิคเหล่านี้ได้แก่ การจัดลำดับ Illumina, การจัดลำดับ Roche 454, การจัดลำดับ Ion Proton และการจัดลำดับ SOLiD (การจัดลำดับโดย Oligo Ligation Detection) ระบบ NGS เร็วกว่าและถูกกว่า สี่วิธีการจัดลำดับดีเอ็นเอหลักที่ใช้ในระบบ NGS คือ; การจัดลำดับโดยการสังเคราะห์ การหาลำดับโดยการทำ ligation และการจัดลำดับด้วยไอออนเซมิคอนดักเตอร์ สามารถจัดลำดับสาย DNA หรือ RNA จำนวนมาก (ล้าน) แบบคู่ขนานกันได้ ช่วยให้สามารถจัดลำดับจีโนมทั้งหมดของสิ่งมีชีวิตได้ภายในระยะเวลาอันสั้น ซึ่งแตกต่างจากการจัดลำดับของแซงเจอร์ซึ่งต้องใช้เวลามากกว่า
NGS มีข้อดีมากกว่าวิธีการจัดลำดับแบบเดิมของ Sanger เป็นกระบวนการที่มีความเร็วสูง แม่นยำ และคุ้มค่ามากขึ้น ซึ่งสามารถทำได้ด้วยขนาดตัวอย่างที่เล็ก สามารถใช้ NGS ในการศึกษาเมทาโนมิก ในการตรวจหาการเปลี่ยนแปลงภายในจีโนมแต่ละตัวเนื่องจากการแทรกและการลบ ฯลฯ และในการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน
Figure_1: การพัฒนาในการจัดลำดับ NGS
Sanger Sequencing คืออะไร
Sanger Sequencing เป็นวิธีการจัดลำดับที่พัฒนาโดย Frederick Sanger และเพื่อนร่วมงานของเขาในปี 1977 เพื่อกำหนดลำดับนิวคลีโอไทด์ที่แม่นยำของชิ้นส่วน DNA ที่กำหนด เรียกอีกอย่างว่าการจัดลำดับการยุติลูกโซ่หรือการจัดลำดับ Dideoxy หลักการทำงานของวิธีนี้คือการยุติการสังเคราะห์เส้นใยโดยการคัดเลือกไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์ (ddNTPs) ที่ยุติลูกโซ่ เช่น ddGTP, ddCTP, ddATP และ ddTTP โดย DNA polymerase ในระหว่างการจำลองแบบของ DNA นิวคลีโอไทด์ปกติมีหมู่ OH 3 หมู่สำหรับการก่อตัวของพันธะฟอสโฟไดสเตอร์ระหว่างนิวคลีโอไทด์ที่อยู่ติดกันเพื่อดำเนินการสร้างเกลียวต่อไป อย่างไรก็ตาม ddNTPs ขาดหมู่ OH 3 'นี้ และไม่สามารถสร้างพันธะฟอสโฟไดสเตอร์ระหว่างนิวคลีโอไทด์ได้ ดังนั้นการยืดตัวของโซ่จึงหยุดลง
ในวิธีนี้ DNA สายเดี่ยวที่จะถูกจัดลำดับทำหน้าที่เป็นสายแม่แบบสำหรับการสังเคราะห์ DNA ในหลอดทดลองข้อกำหนดอื่นๆ ได้แก่ ไพรเมอร์โอลิโกนิวคลีโอไทด์ สารตั้งต้นของดีออกซีนิวคลีโอไทด์ และเอนไซม์ DNA พอลิเมอเรส เมื่อทราบส่วนปลายขนาบของชิ้นส่วนเป้าหมาย ไพรเมอร์สามารถออกแบบได้ง่ายสำหรับการจำลองดีเอ็นเอ ปฏิกิริยาการสังเคราะห์ดีเอ็นเอที่แยกจากกันสี่ตัวดำเนินการในหลอดสี่หลอดที่แยกจากกัน แต่ละหลอดมี ddNTP แยกจากกัน พร้อมกับข้อกำหนดอื่นๆ จากนิวคลีโอไทด์เฉพาะ จะมีการเติมส่วนผสมของ dNTP และ ddNTP ในทำนองเดียวกัน ปฏิกิริยาที่แยกจากกันสี่ตัวจะดำเนินการในหลอดสี่หลอดที่มีสารผสมสี่ชนิด หลังจากเกิดปฏิกิริยาแล้ว การตรวจจับชิ้นส่วนดีเอ็นเอและการแปลงรูปแบบชิ้นส่วนเป็นข้อมูลลำดับ ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เป็นผลลัพธ์จะถูกแปลงสภาพด้วยความร้อนและแยกจากกันโดยเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส หากใช้นิวคลีโอไทด์กัมมันตภาพรังสี รูปแบบแถบในเจลโพลีอะคริลาไมด์สามารถมองเห็นได้ด้วยการถ่ายภาพรังสีอัตโนมัติ เมื่อวิธีนี้ใช้ไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์ที่ติดแท็กเรืองแสง จะสามารถลดการอ่านเจลและส่งผ่านลำแสงเลเซอร์เพื่อตรวจจับโดยเครื่องตรวจจับเรืองแสงได้เพื่อหลีกเลี่ยงข้อผิดพลาดที่อาจเกิดขึ้นเมื่อลำดับการอ่านด้วยตาและป้อนลงในคอมพิวเตอร์ด้วยตนเอง วิธีนี้จึงพัฒนาเป็นการใช้ซีเควนเซอร์อัตโนมัติควบคู่ไปกับคอมพิวเตอร์
นี่คือวิธีการที่ใช้ในการจัดลำดับ DNA จากโครงการจีโนมมนุษย์ วิธีนี้ยังคงใช้กับการปรับเปลี่ยนขั้นสูงอยู่ เนื่องจากจะให้ข้อมูลลำดับที่ถูกต้องแม้จะเป็นกระบวนการที่มีราคาแพงและช้า
Figure_2: Sanger Sequencing
ความแตกต่างระหว่างการจัดลำดับ NGS และแซงเจอร์
NGS กับ Sanger Sequencing |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) หมายถึงกระบวนการจัดลำดับปริมาณงานสูงที่ทันสมัย อธิบายเทคโนโลยีการจัดลำดับสมัยใหม่ที่แตกต่างกันจำนวนมาก | Sanger Sequencing เป็นวิธีการจัดลำดับที่พัฒนาโดย Frederick Sanger เพื่อกำหนดลำดับนิวคลีโอไทด์ที่แม่นยำของชิ้นส่วน DNA ที่กำหนด |
| ความคุ้มค่า | |
| NGS เป็นกระบวนการที่ถูกกว่าเพราะลดเวลา กำลังคน และสารเคมี | นี่เป็นกระบวนการที่มีค่าใช้จ่ายสูงเพราะต้องใช้เวลา กำลังคน และสารเคมีมากขึ้น |
| ความเร็ว | |
| ซึ่งเร็วกว่านี้เนื่องจากทั้งการตรวจจับสารเคมีและการตรวจจับสัญญาณของเส้นหลายเส้นกำลังขนานกัน | สิ่งนี้ใช้เวลานานเนื่องจากการตรวจจับสารเคมีและการตรวจจับสัญญาณเกิดขึ้นเป็นสองกระบวนการที่แยกจากกันและสามารถอ่านได้ครั้งละหนึ่งเกลียวเท่านั้น |
| ความน่าเชื่อถือ | |
| NGS เชื่อถือได้ | การเรียงลำดับ Sanger มีความน่าเชื่อถือน้อยกว่า |
| ขนาดตัวอย่าง | |
| NGS ต้องการ DNA น้อยลง | วิธีนี้ต้องการ DNA เทมเพลตจำนวนมาก |
| ฐาน DNA ต่อ Fragment ที่เรียงลำดับกัน | |
| จำนวน DNA เบสต่อชิ้นส่วนที่จัดลำดับต่ำกว่าวิธี Sanger | การสร้างลำดับยาวกว่าลำดับ NGS |
สรุป – NGS vs Sanger Sequencing
NGS และ Sanger Sequencing เป็นเทคนิคการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในอณูชีววิทยา การจัดลำดับ Sanger เป็นวิธีการจัดลำดับต้นซึ่งถูกแทนที่ด้วย NGS ความแตกต่างที่สำคัญระหว่าง NGS และ Sanger Sequencing คือ NGS เป็นกระบวนการที่มีความเร็วสูง แม่นยำ และคุ้มค่ากว่าการจัดลำดับ Sangerเทคนิคทั้งสองทำให้เกิดการระบาดครั้งใหญ่ในพันธุศาสตร์และเทคโนโลยีชีวภาพ
