ความแตกต่างที่สำคัญ – การจัดลำดับแซงเจอร์ vs ไพโรเควนซิ่ง
การจัดลำดับ DNA มีความสำคัญมากสำหรับการวิเคราะห์ DNA เนื่องจากความรู้เกี่ยวกับการจัดเรียงนิวคลีโอไทด์ที่ถูกต้องในบริเวณ DNA นั้นเผยให้เห็นข้อมูลที่สำคัญมากมายเกี่ยวกับมัน มีวิธีการจัดลำดับดีเอ็นเอที่แตกต่างกัน Sanger sequencing และ Pyrosequencing เป็นวิธีการหาลำดับดีเอ็นเอที่แตกต่างกันสองวิธีที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในอณูชีววิทยา ความแตกต่างที่สำคัญระหว่างการจัดลำดับ Sanger และ Pyrosequencing ก็คือการจัดลำดับของ Sanger ใช้ไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์เพื่อยุติการสังเคราะห์ดีเอ็นเอเพื่ออ่านลำดับนิวคลีโอไทด์ในขณะที่ไพโรเซเควนซิ่งตรวจจับการปลดปล่อยไพโรฟอสเฟตโดยผสมผสานนิวคลีโอไทด์และสังเคราะห์ลำดับเสริมเพื่ออ่านลำดับที่แม่นยำของลำดับ
Sanger Sequencing คืออะไร
Sanger sequencing เป็นวิธีการจัดลำดับ DNA รุ่นแรกที่พัฒนาโดย Frederick Sanger และวิทยาลัยของเขาในปี 1977 เป็นที่รู้จักกันว่า Chain Termination Sequencing หรือ Dideoxy sequencing เนื่องจากมีพื้นฐานมาจากการยุติลูกโซ่โดย dideoxynucleotides (ddNTPs) วิธีนี้ใช้กันอย่างแพร่หลายมากว่า 30 ปี จนกระทั่งมีการพัฒนา New Generation Sequencing (NGS) เทคนิคการหาลำดับของ Sanger ช่วยให้สามารถค้นพบลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ถูกต้องหรือการยึดติดของชิ้นส่วนดีเอ็นเอเฉพาะ มันขึ้นอยู่กับการรวมการคัดเลือกของ ddNTP และการสิ้นสุดของการสังเคราะห์ DNA ระหว่างการจำลองแบบ DNA ในหลอดทดลอง การไม่มีหมู่ OH 3 ' เพื่อสร้างพันธะฟอสโฟไดสเตอร์ต่อไประหว่างนิวคลีโอไทด์ที่อยู่ติดกันเป็นคุณลักษณะเฉพาะของ ddNTPs ดังนั้น เมื่อติดตั้ง ddNTP แล้ว การยืดตัวของโซ่จะหยุดและสิ้นสุดจากจุดนั้น มี ddNTP สี่ตัว ได้แก่ ddATP, ddCTP, ddGTP และ ddTTP ซึ่งใช้ในการจัดลำดับ Sanger นิวคลีโอไทด์เหล่านี้จะหยุดกระบวนการจำลองดีเอ็นเอเมื่อรวมเข้ากับสายดีเอ็นเอที่กำลังเติบโตและส่งผลให้ DNA สั้นยาวต่างกันไปCapillary gel electrophoresis ใช้ในการจัดระเบียบสาย DNA สั้น ๆ เหล่านี้ตามขนาดของมันบนเจลดังแสดงในรูปที่ 01.
รูปที่ 1: capillary gel electrophoresis ของ DNA สั้นสังเคราะห์
สำหรับการจำลอง DNA ในหลอดทดลอง ควรมีข้อกำหนดบางประการ พวกมันคือเอ็นไซม์ DNA polymerase, template DNA, ไพรเมอร์โอลิโกนิวคลีโอไทด์ และดีออกซีนิวคลีโอไทด์ (dNTPs) ในการหาลำดับแซงเจอร์ การจำลองดีเอ็นเอจะดำเนินการในหลอดทดลองสี่หลอดแยกกันพร้อมกับ ddNTP สี่ประเภทแยกกัน ดีออกซีนิวคลีโอไทด์ไม่ได้ถูกแทนที่โดยสิ้นเชิงด้วย ddNTP ตามลำดับ ส่วนผสมของ dNTP เฉพาะ (เช่น dATP + ddATP) ถูกรวมไว้ในหลอดและทำซ้ำ ผลิตภัณฑ์หลอดสี่แบบแยกกันทำงานบนเจลในสี่หลุมแยกกัน จากนั้นการอ่านเจลจะสร้างลำดับดังแสดงในรูปที่ 02
รูปที่ 02: การจัดลำดับ Sanger
Sager sequencing เป็นเทคนิคสำคัญที่ช่วยในหลาย ๆ ด้านของอณูชีววิทยา โครงการจีโนมมนุษย์เสร็จสมบูรณ์ด้วยความช่วยเหลือของวิธีการจัดลำดับของแซงเจอร์ การจัดลำดับแซงเจอร์ยังมีประโยชน์ในการหาลำดับดีเอ็นเอเป้าหมาย การวิจัยโรคมะเร็งและโรคทางพันธุกรรม การวิเคราะห์การแสดงออกของยีน การระบุตัวตนของมนุษย์ การตรวจหาเชื้อโรค การจัดลำดับจุลินทรีย์ ฯลฯ
มีข้อเสียหลายประการของการจัดลำดับ Sanger:
- ความยาวของ DNA ที่จัดลำดับต้องไม่เกิน 1,000 คู่เบส
- สามารถจัดลำดับได้ครั้งละหนึ่งเส้นเท่านั้น
- กระบวนการนี้ใช้เวลานานและมีราคาแพง
ดังนั้น เทคนิคการจัดลำดับขั้นสูงแบบใหม่จึงได้รับการพัฒนาพร้อมเวลาที่จะเอาชนะปัญหาเหล่านี้ อย่างไรก็ตาม การจัดลำดับ Sanger ยังคงใช้งานอยู่เนื่องจากผลลัพธ์ที่แม่นยำสูงจนถึงชิ้นส่วนความยาวคู่เบสประมาณ 850 ชิ้น
Pyrosequencing คืออะไร
Pyrosequencing เป็นเทคนิคการจัดลำดับดีเอ็นเอแบบใหม่โดยอิงจาก "การจัดลำดับโดยการสังเคราะห์" เทคนิคนี้อาศัยการตรวจจับการปลดปล่อยไพโรฟอสเฟตจากการรวมตัวของนิวคลีโอไทด์ กระบวนการนี้ใช้โดยเอ็นไซม์ที่แตกต่างกัน 4 ชนิด ได้แก่ DNA polymerse, ATP sulfurylase, luciferase และ apyrase และซับสเตรต 2 ตัวของ adenosine 5’ phosphosulfate (APS) และ luciferin
กระบวนการเริ่มต้นด้วยการรวมตัวของไพรเมอร์ด้วยแม่แบบ DNA แบบสายเดี่ยว และ DNA polymerase เริ่มการรวมตัวของนิวคลีโอไทด์ที่เสริมเข้าด้วยกัน เมื่อนิวคลีโอไทด์รวมกัน (กรดนิวคลีอิกพอลิเมอไรเซชัน) จะปล่อยกลุ่มไพโรฟอสเฟต (กลุ่มฟอสเฟตสองกลุ่มที่ผูกไว้ด้วยกัน) และพลังงานการเติมนิวคลีโอไทด์แต่ละครั้งจะปล่อยปริมาณไพโรฟอสเฟตที่เท่ากัน ไพโรฟอสเฟตแปลงเป็น ATP โดย ATP sulfurylase ต่อหน้า APS ของซับสเตรต ATP ที่สร้างขึ้นจะขับเคลื่อนการเปลี่ยนจากลูซิเฟอรินเป็นสื่อกลางของลูซิเฟอรินไปเป็นออกซีลูซิเฟอริน ทำให้เกิดแสงที่มองเห็นได้ในปริมาณที่เป็นสัดส่วนกับปริมาณของเอทีพี แสงถูกตรวจจับโดยอุปกรณ์ตรวจจับโฟตอนหรือโดยโฟโตมัลติพลายเออร์และสร้างไพโรแกรม อะไพเรสจะย่อยสลาย ATP และ dNTP ที่ไม่รวมอยู่ในส่วนผสมของปฏิกิริยา การเพิ่ม dNTP ทำได้ทีละครั้ง เนื่องจากการเติมนิวคลีโอไทด์เป็นที่รู้จักกันตามการรวมตัวและการตรวจจับแสง ลำดับของเทมเพลตจึงสามารถกำหนดได้ Pyrogram ใช้สำหรับสร้างลำดับนิวคลีโอไทด์ของ DNA ตัวอย่างดังแสดงในรูปที่ 03.
Pyrosequencing มีความสำคัญมากในการวิเคราะห์ single nucleotide polymorphism และการจัดลำดับของ DNA ช่วงสั้น ความแม่นยำสูง ความยืดหยุ่น ความง่ายของระบบอัตโนมัติ และการประมวลผลแบบคู่ขนานเป็นข้อดีของการทำไพโรเควนซิ่งเหนือเทคนิคการจัดลำดับของแซงเจอร์
รูปที่ 03: Pyrosequencing
Sanger Sequencing กับ Pyrosequencing ต่างกันอย่างไร
แซงเจอร์ vs ไพโรเซเควนซิ่ง |
|
| Sanger sequencing เป็นวิธีการจัดลำดับ DNA ที่อิงจากการรวมตัวกันแบบเลือกของ ddNTPs โดย DNA polymerase และการสิ้นสุดสายโซ่ | Pyrosequencing เป็นวิธีการจัดลำดับดีเอ็นเอโดยอาศัยการตรวจจับการปล่อยไพโรฟอสเฟตเมื่อรวมตัวของนิวคลีโอไทด์ |
| การใช้ ddNTP | |
| ddNTPs ใช้เพื่อยุติการจำลองดีเอ็นเอ | ddNTP ไม่ได้ใช้ |
| เอนไซม์ที่เกี่ยวข้อง | |
| DNA พอลิเมอเรสถูกใช้ | ใช้เอนไซม์สี่ชนิด: DNA polymerase, ATP sulfurylase, Luciferase และ Apyrase |
| สารตั้งต้นที่ใช้ | |
| APS และ Luciferin ไม่ได้ใช้ | ใช้อะดีโนซีน 5’ ฟอสโฟซัลเฟต (APS) และลูซิเฟอริน |
| อุณหภูมิสูงสุด | |
| นี่เป็นกระบวนการที่ช้า | นี่เป็นกระบวนการที่รวดเร็ว |
สรุป – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger sequencing และ Pyrosequencing เป็นวิธีการหาลำดับดีเอ็นเอสองวิธีที่ใช้ในอณูชีววิทยา การจัดลำดับ Sanger สร้างลำดับของนิวคลีโอไทด์ตามลำดับโดยการยุติการยืดตัวของสายโซ่ ในขณะที่การจัดลำดับแบบไพโรซายน์จะสร้างลำดับที่แม่นยำของนิวคลีโอไทด์ตามลำดับโดยการรวมตัวของนิวคลีโอไทด์และตรวจจับการปลดปล่อยของไพโรฟอสเฟตดังนั้น ความแตกต่างที่สำคัญระหว่างการจัดลำดับ Sanger และ Pyrosequencing ก็คือการจัดลำดับของ Sanger ทำงานกับการจัดลำดับโดยการยุติลูกโซ่ ในขณะที่การจัดลำดับของ Sanger จะทำงานในการหาลำดับโดยการสังเคราะห์
