ความแตกต่างที่สำคัญ – Microarray vs RNA Sequencing
Transcriptome แสดงถึงเนื้อหาทั้งหมดของ RNA ที่มีอยู่ในเซลล์ รวมถึง mRNA, rRNA, tRNA, RNA ที่เสื่อมโทรม และ RNA ที่ไม่ย่อยสลาย การทำโปรไฟล์ทรานสคริปต์เป็นกระบวนการที่สำคัญเพื่อทำความเข้าใจข้อมูลเชิงลึกของเซลล์ มีวิธีการขั้นสูงหลายวิธีในการทำโปรไฟล์การถอดเสียง การจัดลำดับ Microarray และ RNA เป็นเทคโนโลยีสองประเภทที่พัฒนาขึ้นเพื่อวิเคราะห์การถอดรหัส ความแตกต่างที่สำคัญระหว่างการจัดลำดับ microarray และ RNA คือ microarray นั้นขึ้นอยู่กับศักยภาพของการผสมข้ามพันธุ์ของโพรบที่ติดฉลากที่ออกแบบไว้ล่วงหน้าพร้อมลำดับ cDNA เป้าหมาย ในขณะที่การจัดลำดับ RNA นั้นขึ้นอยู่กับการจัดลำดับโดยตรงของสาย cDNA โดยเทคนิคการหาลำดับขั้นสูง เช่น NGSMicroarray ดำเนินการด้วยความรู้ก่อนหน้าเกี่ยวกับลำดับและการจัดลำดับ RNA จะดำเนินการโดยไม่ต้องมีความรู้เกี่ยวกับลำดับก่อน
ไมโครเรย์คืออะไร
Microarray เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพ เชื่อถือได้ และให้ปริมาณงานสูงซึ่งใช้สำหรับการทำโปรไฟล์การถอดรหัสโดยนักวิทยาศาสตร์ เป็นวิธีที่ได้รับความนิยมมากที่สุดสำหรับการวิเคราะห์การถอดเสียง เป็นวิธีการที่มีต้นทุนต่ำซึ่งขึ้นอยู่กับโพรบไฮบริด
เทคนิคเริ่มต้นด้วยการแยก mRNA จากตัวอย่างและสร้างไลบรารี cDNA จาก RNA ทั้งหมด จากนั้นจะผสมกับโพรบที่ออกแบบไว้ล่วงหน้าที่ติดฉลากเรืองแสงไว้บนพื้นผิวแข็ง (สปอตเมทริกซ์) ลำดับเสริมจะผสมพันธุ์กับโพรบที่ติดฉลากไว้ในไมโครอาร์เรย์ จากนั้น microarray จะถูกล้างและคัดกรอง และภาพจะถูกวัดปริมาณ ควรวิเคราะห์ข้อมูลที่รวบรวมเพื่อให้ได้โปรไฟล์นิพจน์ที่สัมพันธ์กัน
ความเข้มของโพรบ microarray จะถือว่าเป็นสัดส่วนกับปริมาณของการถอดเสียงในตัวอย่างอย่างไรก็ตาม ความแม่นยำของเทคนิคขึ้นอยู่กับโพรบที่ออกแบบ ความรู้ก่อนหน้าของลำดับ และความสัมพันธ์ของโพรบสำหรับไฮบริไดเซชัน ดังนั้นเทคโนโลยี microarray จึงมีข้อจำกัด เทคนิค Microarray ไม่สามารถทำได้ด้วยการถอดเสียงที่มีปริมาณน้อย ไม่สามารถแยกแยะไอโซฟอร์มและระบุตัวแปรทางพันธุกรรมได้ เนื่องจากวิธีนี้ขึ้นอยู่กับการผสมข้ามพันธุ์ของโพรบ ปัญหาบางอย่างที่เกี่ยวข้องกับการผสมข้ามพันธุ์ เช่น การผสมข้ามพันธุ์ การผสมข้ามพันธุ์แบบไม่เฉพาะเจาะจง ฯลฯ เกิดขึ้นในเทคนิคไมโครเรย์
รูปที่ 01: Microarray
การจัดลำดับ RNA คืออะไร
RNA shotgun sequencing (RNA seq) เป็นเทคนิคการหาลำดับ เป็นวิธีการสร้างโปรไฟล์การถอดรหัสที่รวดเร็วและปริมาณงานสูง มันวัดปริมาณการแสดงออกของยีนโดยตรงและส่งผลให้เกิดการตรวจสอบเชิงลึกของการถอดรหัสRNA seq ไม่ได้ขึ้นอยู่กับโพรบที่ออกแบบไว้ล่วงหน้าหรือความรู้ก่อนหน้าของลำดับ ดังนั้นวิธี RNA seq จึงมีความไวสูงและความสามารถในการตรวจหายีนใหม่และตัวแปรทางพันธุกรรม
วิธีการจัดลำดับ RNA ทำได้หลายขั้นตอน RNA ทั้งหมดของเซลล์จะต้องถูกแยกและแยกส่วน จากนั้น การใช้ reverse transcriptase จะต้องเตรียมไลบรารี cDNA แต่ละสาย cDNA จะต้องถูกมัดด้วยอะแด็ปเตอร์ จากนั้นชิ้นส่วนที่ผูกมัดจะต้องถูกขยายและทำให้บริสุทธิ์ สุดท้ายโดยใช้วิธี NGS จะต้องดำเนินการหาลำดับของ cDNA
รูปที่ 02: การจัดลำดับอาร์เอ็นเอ
ความแตกต่างระหว่างการเรียงลำดับ Microarray และ RNA คืออะไร
ไมโครอาเรย์กับการจัดลำดับอาร์เอ็นเอ |
|
| Microarray เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพ เชื่อถือได้ และให้ปริมาณงานสูง | การจัดลำดับ RNA เป็นวิธีการที่แม่นยำและมีปริมาณงานสูง |
| ต้นทุน | |
| นี่คือวิธีราคาประหยัด | นี่เป็นวิธีที่แพง |
| การวิเคราะห์ตัวอย่างจำนวนมาก | |
| ช่วยให้วิเคราะห์ตัวอย่างจำนวนมากได้พร้อมๆ กัน | ช่วยให้วิเคราะห์ตัวอย่างจำนวนมากได้ง่ายขึ้น |
| การวิเคราะห์ข้อมูล | |
| การวิเคราะห์ข้อมูลซับซ้อน | ข้อมูลเพิ่มเติมถูกสร้างขึ้นในวิธีนี้ ดังนั้นกระบวนการจึงซับซ้อนมากขึ้น |
| ความรู้ก่อนหน้าของลำดับ | |
| วิธีนี้ใช้โพรบไฮบริไดเซชัน ดังนั้นจำเป็นต้องรู้ลำดับก่อนล่วงหน้า | วิธีนี้ไม่ขึ้นอยู่กับความรู้ในลำดับก่อนหน้า |
| รูปแบบโครงสร้างและยีนนวนิยาย | |
| วิธีนี้ตรวจไม่พบความแปรผันของโครงสร้างและยีนใหม่ | วิธีการนี้สามารถตรวจจับความผันแปรของโครงสร้าง เช่น การหลอมรวมของยีน การต่อแบบทางเลือก และยีนแบบใหม่ |
| ความไว | |
| สิ่งนี้ตรวจไม่พบความแตกต่างในการแสดงออกของไอโซฟอร์ม ดังนั้นจึงมีความไวที่จำกัด | มีความไวสูง |
| ผลลัพธ์ | |
| สิ่งนี้สามารถส่งผลให้ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์เท่านั้น สิ่งนี้ไม่ได้ให้ปริมาณที่แน่นอนของการแสดงออกของยีน | มันให้ระดับการแสดงออกสัมบูรณ์และสัมพัทธ์ |
| วิเคราะห์ข้อมูลใหม่ | |
| ต้องฉายซ้ำเพื่อวิเคราะห์ใหม่ | สามารถวิเคราะห์ข้อมูลการจัดลำดับใหม่ได้ |
| ความต้องการเฉพาะบุคลากรและโครงสร้างพื้นฐาน | |
| ไม่จำเป็นต้องใช้โครงสร้างพื้นฐานและบุคลากรเฉพาะสำหรับ microarray | โครงสร้างพื้นฐานเฉพาะและบุคลากรที่จำเป็นสำหรับการจัดลำดับอาร์เอ็นเอ |
| ปัญหาทางเทคนิค | |
| เทคนิคไมโครอาเรย์มีปัญหาทางเทคนิค เช่น การผสมข้ามพันธุ์ การผสมข้ามพันธุ์แบบไม่เฉพาะเจาะจง อัตราการตรวจจับที่จำกัดของโพรบแต่ละตัว เป็นต้น | เทคนิค RNA seq หลีกเลี่ยงปัญหาทางเทคนิค เช่น การผสมข้ามพันธุ์ การผสมข้ามพันธุ์แบบไม่เฉพาะเจาะจง อัตราการตรวจจับที่จำกัดของโพรบแต่ละตัว เป็นต้น |
| อคติ | |
| นี่เป็นวิธีการแบบลำเอียงเพราะมันขึ้นอยู่กับการผสมข้ามพันธุ์ | อคติต่ำเมื่อเทียบกับ microarray |
สรุป – Microarray vs RNA Sequencing
วิธีการจัดลำดับ Microarray และ RNA เป็นแพลตฟอร์มปริมาณงานสูงที่พัฒนาขึ้นสำหรับการทำโปรไฟล์การถอดรหัส ทั้งสองวิธีให้ผลลัพธ์ที่มีความสัมพันธ์สูงกับโปรไฟล์การแสดงออกของยีน อย่างไรก็ตาม การจัดลำดับ RNA มีข้อได้เปรียบเหนือ microarray สำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน การจัดลำดับอาร์เอ็นเอเป็นวิธีที่ละเอียดอ่อนกว่าในการตรวจหาทรานสคริปต์ที่มีความอุดมสมบูรณ์ต่ำกว่าไมโครอาร์เรย์ การจัดลำดับอาร์เอ็นเอยังช่วยให้สามารถแยกความแตกต่างระหว่างไอโซฟอร์มและการระบุตัวแปรของยีนได้ อย่างไรก็ตาม microarray เป็นทางเลือกทั่วไปสำหรับนักวิจัยส่วนใหญ่ เนื่องจากการจัดลำดับอาร์เอ็นเอเป็นเทคนิคใหม่และมีราคาแพง โดยมีความท้าทายในการจัดเก็บข้อมูลและการวิเคราะห์ข้อมูลที่ซับซ้อน
