ความแตกต่างที่สำคัญ – PCR vs DNA Sequencing
PCR และการจัดลำดับ DNA เป็นสองเทคนิคที่สำคัญในอณูชีววิทยา ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์ (PCR) เป็นกระบวนการที่สร้างสำเนาชิ้นส่วนดีเอ็นเอจำนวนมาก การจัดลำดับดีเอ็นเอเป็นเทคนิคที่ส่งผลให้ลำดับนิวคลีโอไทด์ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่กำหนดได้อย่างแม่นยำ นี่คือข้อแตกต่างที่สำคัญระหว่างการจัดลำดับ PCR และ DNA PCR เป็นหนึ่งในขั้นตอนสำคัญที่เกี่ยวข้องกับการจัดลำดับดีเอ็นเอ
PCR คืออะไร
Polymerase Chain Reaction (PCR) เป็นเทคนิคการขยายดีเอ็นเอที่ใช้ในอณูชีววิทยา มันผลิตสำเนาของชิ้นส่วนดีเอ็นเอเฉพาะจำนวนหลายพันถึงล้านสำเนาวิธีนี้ได้รับการพัฒนาโดย Kary Mullis ในปี 1983 ในเทคนิคนี้ ส่วนของ DNA ที่จะขยายทำหน้าที่เป็นแม่แบบ และเอนไซม์ DNA polymerase จะเพิ่มนิวคลีโอไทด์เสริมให้กับไพรเมอร์ซึ่งมีอยู่ในส่วนผสม PCR ในตอนท้ายของปฏิกิริยา PCR จะมีการสังเคราะห์ DNA ตัวอย่างจำนวนมาก
มีส่วนประกอบที่แตกต่างกันของส่วนผสม PCR ได้แก่ DNA, DNA polymerase (Taq polymerase), primers (forward and reverse primers), nucleotides (building blocks of DNA) และบัฟเฟอร์ PCR เกิดขึ้นภายในเครื่อง PCR และควรโหลดส่วนผสม PCR ที่ถูกต้องลงในเครื่อง และควรขับเคลื่อนโปรแกรมที่ถูกต้อง เทคนิคนี้ช่วยให้สามารถผลิต DNA เฉพาะส่วนจำนวนหลายพันถึงล้านสำเนาจาก DNA จำนวนเล็กน้อยได้
PCR ปฏิกิริยาเกิดขึ้นในลักษณะวัฏจักรเพื่อผลิตผลิตภัณฑ์ PCR จำนวนที่มองเห็นได้บนเจล มีสามขั้นตอนหลักที่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยา PCR ได้แก่ การทำให้เสียสภาพ การหลอมด้วยไพรเมอร์ และการขยายเกลียวดังแสดงในรูปที่ 01สามขั้นตอนเหล่านี้เกิดขึ้นที่อุณหภูมิต่างกันสามระดับ ดีเอ็นเอมีอยู่ในรูปแบบเกลียวคู่โดยพันธะไฮโดรเจนระหว่างเบสคู่สม ก่อนที่จะมีนัยสำคัญ ควรแยก DNA ที่มีสายคู่ออกจากกัน ทำได้โดยให้อุณหภูมิสูง ที่อุณหภูมิสูง ดีเอ็นเอสายคู่จะถูกแปลงเป็นสายเดี่ยว จากนั้นไพรเมอร์ควรเข้าใกล้ปลายขนาบข้างของชิ้นส่วนหรือยีนของดีเอ็นเอ ไพรเมอร์คือ DNA สายเดี่ยวสั้นๆ ที่ประกอบเข้ากับลำดับเป้าหมาย ไพรเมอร์ไปข้างหน้าและข้างหลังหลอมด้วยฐานเสริมที่ปลายขนาบข้างของ DNA ตัวอย่างที่แปลงสภาพที่อุณหภูมิการหลอม สีรองพื้นควรทนความร้อน เมื่อไพรเมอร์หลอมด้วย DNA ตัวอย่าง เอนไซม์ taq polymerase จะเริ่มการสังเคราะห์สายใหม่โดยการเพิ่มนิวคลีโอไทด์ซึ่งเป็นส่วนเติมเต็มของ DNA เป้าหมาย Taq polymerase เป็นเอนไซม์ที่มีความเสถียรทางความร้อนที่แยกได้จากแบคทีเรียที่มีอุณหภูมิความร้อนที่เรียกว่า Thermus aquaticus บัฟเฟอร์ PCR รักษาสภาวะที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการกระทำของ taq polymeraseปฏิกิริยา PCR ทั้งสามขั้นตอนนี้ถูกทำซ้ำเพื่อผลิตผลิตภัณฑ์ PCR ตามปริมาณที่ต้องการ หลังจากแต่ละปฏิกิริยา PCR จำนวนสำเนา DNA จะเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่า ดังนั้น สามารถสังเกตการขยายแบบเอ็กซ์โปเนนเชียลใน PCR ผลิตภัณฑ์ PCR สามารถสังเกตได้โดยใช้เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส และสามารถทำให้บริสุทธิ์เพื่อการศึกษาต่อไปได้
รูปที่ 01: ขั้นตอนสำคัญของปฏิกิริยา PCR
PCR เป็นเครื่องมือที่มีคุณค่าในการวิจัยทางการแพทย์และชีวภาพ PCR มีคุณค่าพิเศษในด้านนิติวิทยาศาสตร์ เนื่องจากสามารถขยาย DNA เพื่อการศึกษาจากตัวอย่างเล็กๆ จากอาชญากร และสร้างโปรไฟล์ DNA ทางนิติเวชได้ PCR ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในหลาย ๆ ด้านของอณูชีววิทยา เช่น การสร้างยีน การโคลนยีน การตรวจหาการกลายพันธุ์ การจัดลำดับดีเอ็นเอ ไมโครอาร์เรย์ DNA และการทดสอบความเป็นพ่อ เป็นต้น
รูปที่ 02: ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส
DNA Sequencing คืออะไร
DNA sequencing คือการกำหนดลำดับของนิวคลีโอไทด์ที่แม่นยำ เช่น อะดีนีน กัวนีน ไซโตซีน และไทมีนในชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่กำหนด ข้อมูลทางพันธุกรรมถูกเก็บไว้ในลำดับดีเอ็นเอโดยใช้ลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ถูกต้อง ดังนั้น การหาลำดับของนิวคลีโอไทด์ในชิ้นส่วน DNA ที่แม่นยำจึงเป็นสิ่งสำคัญมากที่ต้องรู้เกี่ยวกับโครงสร้างและหน้าที่ของยีน
โปรโตคอลการจัดลำดับ DNA เกี่ยวข้องกับกระบวนการที่แตกต่างกัน ขั้นตอนแรกคือการแยก DNA ที่สนใจหรือจีโนม DNA ของสิ่งมีชีวิต การใช้ PCR (ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น) ควรขยายขอบเขตของ DNA ที่ต้องการ ผลิตภัณฑ์ PCR แบบขยายควรแยกจากกันโดยเจลอิเล็กโตรโฟรีซิสและทำให้บริสุทธิ์ แฟรกเมนต์ขยายเป็นเทมเพลตสำหรับการจัดลำดับการจัดลำดับสามารถทำได้ตามวิธีการจัดลำดับ Sanger หรือวิธีการจัดลำดับปริมาณงานสูง การจัดลำดับแซงเจอร์ต้องใช้อิเล็กโตรโฟรีซิสของเส้นเลือดฝอยของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เป็นผลลัพธ์ การหาลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ถูกต้องสามารถทำได้โดยการอ่าน autoradiographs ด้วยตนเองหรือใช้ซีเควนเซอร์ DNA อัตโนมัติ
การจัดลำดับยีนสนับสนุนโครงการจีโนมมนุษย์และอำนวยความสะดวกในการทำแผนที่ของจีโนมมนุษย์ในปี 2546 ในด้านนิติเวช การจัดลำดับดีเอ็นเอช่วยให้สามารถระบุตัวบุคคลที่แสดงลำดับดีเอ็นเอที่ไม่ซ้ำกันและระบุตัวอาชญากรได้ ในทางการแพทย์ สามารถใช้การจัดลำดับดีเอ็นเอเพื่อตรวจหายีนที่รับผิดชอบต่อโรคทางพันธุกรรมและโรคอื่นๆ ค้นหายีนที่บกพร่อง และแทนที่ด้วยยีนที่ถูกต้อง ในการเกษตร ข้อมูลการจัดลำดับดีเอ็นเอของจุลินทรีย์บางชนิดถูกนำมาใช้เพื่อผลิตพืชดัดแปรพันธุกรรมที่มีลักษณะเฉพาะที่ต้องการทางเศรษฐกิจ
รูปที่ 03: DNA Sequencing
PCR และ DNA Sequencing ต่างกันอย่างไร
PCR กับ DNA Sequencing |
|
| กระบวนการ PCR สร้างสำเนา DNA ที่สนใจหลายพันถึงล้านสำเนา | DNA sequencing เป็นกระบวนการในการกำหนดลำดับที่ชัดเจนของนิวคลีโอไทด์ในชิ้นส่วน DNA ที่กำหนด |
| ผลลัพธ์ | |
| PCR สร้างสำเนาของชิ้นส่วนดีเอ็นเอเฉพาะจำนวนหลายพันถึงล้านสำเนา | ผลลัพธ์ในลำดับเบสที่ถูกต้องในชิ้นส่วนดีเอ็นเอเฉพาะ |
| การมีส่วนร่วมของ ddNTPs | |
| PCR ไม่ต้องการ ddNTP มันใช้ dNTP | DNA sequencing ต้องการ ddNTPs เพื่อยุติการก่อตัวเป็นเกลียว |
สรุป – PCR vs DNA Sequencing
PCR และการจัดลำดับ DNA เป็นเครื่องมือที่สำคัญมากในหลาย ๆ ด้านของอณูชีววิทยา การขยายชิ้นส่วน DNA ทำได้โดยเทคนิค PCR ในขณะที่ลำดับที่ถูกต้องของนิวคลีโอไทด์ของชิ้นส่วน DNA จะพิจารณาจากการจัดลำดับดีเอ็นเอ นี่คือความแตกต่างระหว่างการจัดลำดับ PCR และ DNA
