ความแตกต่างที่สำคัญ – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
นิวคลีโอไทด์เป็นหน่วยโครงสร้างพื้นฐานและหน่วยการสร้างของดีเอ็นเอ โมเลกุลดีเอ็นเอประกอบด้วยสายพอลินิวคลีโอไทด์ มีนิวคลีโอไทด์ที่แตกต่างกันสี่ชนิดที่พบใน DNA นิวคลีโอไทด์เหล่านี้ประกอบด้วยเบสไนโตรเจนสี่ชนิดที่แตกต่างกันชื่อ A (อะดีนีน), G (กัวนีน), C (ไซโตซีน), T (ไทมีน) ลำดับของนิวคลีโอไทด์ในโมเลกุลดีเอ็นเอมีความสำคัญอย่างยิ่ง เนื่องจากเข้ารหัสข้อมูลทางพันธุกรรมที่สำคัญสำหรับการเจริญเติบโตและการพัฒนาของสิ่งมีชีวิต การจัดลำดับดีเอ็นเอหมายถึงกระบวนการที่กำหนดลำดับนิวคลีโอไทด์ที่แม่นยำของดีเอ็นเอ มีวิธีการจัดลำดับดีเอ็นเอที่แตกต่างกันการจัดลำดับ Maxam Gilbert และการจัดลำดับ DNA ของ Sanger เป็นวิธีการจัดลำดับ DNA สองวิธีซึ่งเป็นของการจัดลำดับรุ่นแรก ขั้นตอนการหาลำดับของ Maxam Gilbert กำหนดลำดับเบสโดยการตัดแยกชิ้นส่วน DNA ที่ติดฉลากปลาย 5' ทางเคมีโดยชอบที่แต่ละนิวคลีโอไทด์และเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส ขั้นตอนการจัดลำดับ Sanger กำหนดลำดับนิวคลีโอไทด์โดยการสังเคราะห์ DNA แบบสายเดี่ยวโดยใช้ DNA polymerase และ dideoxynucleotides และเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส นี่คือข้อแตกต่างที่สำคัญระหว่าง Maxam Gilbert และ Sanger Sequencing
Maxam Gilbert Sequencing คืออะไร
Maxam Gilbert หรือที่เรียกว่าวิธีการจัดลำดับทางเคมีเป็นเทคนิคที่พัฒนาขึ้นเพื่อกำหนดลำดับของนิวคลีโอไทด์ใน DNA วิธีนี้ถูกนำมาใช้โดย W alter Gilbert และ Alan Maxam ในปี 1976 และได้รับความนิยมเนื่องจากสามารถทำได้โดยตรงกับ DNA บริสุทธิ์ วิธีการของ Maxam Gilbert เป็นของการจัดลำดับ DNA รุ่นแรก และเป็นวิธีการจัดลำดับแบบแรกที่นักวิทยาศาสตร์ใช้กันอย่างแพร่หลาย
หลักการพื้นฐานของวิธีนี้อยู่ที่การจำกัดชิ้นส่วน DNA ที่ติดฉลากปิดท้ายที่เบสจำเพาะโดยสารเคมีและเงื่อนไขเฉพาะของเบส และการแยกชิ้นส่วนที่ติดฉลากด้วยอิเล็กโตรโฟรีซิสดังแสดงในรูปที่ 01 ชิ้นส่วนจะถูกแยกตาม ตามขนาดของเจล เนื่องจากชิ้นส่วนต่างๆ มีการติดฉลาก ลำดับของโมเลกุลดีเอ็นเอจึงสามารถอนุมานได้ง่าย
วิธี Maxam gilbert ใช้สารเคมีเฉพาะพื้นฐานเพื่อทำลาย DNA ที่ฐานเฉพาะ สารเคมีทั่วไปสองชนิดชื่อไดเมทิลซัลเฟตและสารเคมีไฮดราซีนถูกใช้เพื่อคัดเลือกพิวรีนและไพริมิดีนตามลำดับ
วิธีการจัดลำดับ Maxam Gilbert ทำได้หลายขั้นตอนดังนี้
- การทำให้ลำดับดีเอ็นเอบริสุทธิ์โดยใช้เอ็นโดนิวคลีเอสจำกัด
- การติดฉลากส่วนปลายของชิ้นส่วนดีเอ็นเอโดยเติมสารกัมมันตรังสีฟอสเฟต
- การทำให้บริสุทธิ์ของชิ้นส่วนที่ติดฉลากจากชิ้นส่วนที่ไม่ได้ติดฉลากโดยเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส
- การแยก DNA ที่ติดฉลากปิดท้ายออกเป็นสี่หลอดและบำบัดด้วยสารเคมีเฉพาะพื้นฐานแยกกัน
- อิเล็กโทรโฟรีซิสของเนื้อหาในแต่ละหลอดแยกกันบนเจลและแยกชิ้นส่วนตามความยาว
- การตรวจจับชิ้นส่วนด้วย autoradiograph
รูปที่ 01: Maxam Gilbert Sequencing
Sanger Sequencing คืออะไร
Sanger Sequencing เป็นวิธีการจัดลำดับที่พัฒนาโดย Frederick Sanger และเพื่อนร่วมงานของเขาในปี 1977 เพื่อกำหนดลำดับพื้นฐานของชิ้นส่วน DNA ที่กำหนด เรียกอีกอย่างว่าการจัดลำดับการสิ้นสุดลูกโซ่หรือวิธีการจัดลำดับ Dideoxy วิธีนี้ทำงานบนหลักการของการรวมตัวแบบคัดเลือกของไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์ (ddNTPs) ที่ยุติสายโซ่ เช่น ddGTP, ddCTP, ddATP และ ddTTP โดย DNA polymerase ระหว่างการสังเคราะห์ DNA สายเดี่ยวเพื่อยุติการก่อตัวเป็นเกลียวไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์ขาดหมู่ OH 3 'สำหรับการก่อตัวของพันธะฟอสโฟไดสเตอร์กับนิวคลีโอไทด์ที่อยู่ติดกัน ดังนั้น การก่อตัวของเกลียวจะหยุดเมื่อ ddNTP ถูกรวมเข้ากับเกลียวที่สร้างขึ้นใหม่ในระหว่างการจัดลำดับแซงเจอร์
ในวิธีนี้ ปฏิกิริยาการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ (PCR) สี่แบบแยกกันถูกดำเนินการในหลอดสี่หลอดแยกกันที่มี ddNTP หนึ่งประเภท ข้อกำหนดอื่นๆ ยังมีให้สำหรับหลอดสำหรับ PCR รวมถึงไพรเมอร์, dNTP, Taq polymerase, สภาวะเฉพาะ ฯลฯ ปฏิกิริยาแยกกันสี่รายการจะดำเนินการในหลอดสี่หลอดที่มีสารผสมสี่ชนิด หลังจากปฏิกิริยา PCR ชิ้นส่วน DNA ที่เกิดจะถูกแปลงสภาพด้วยความร้อนและแยกออกจากกันด้วยเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส จากนั้นชิ้นส่วนจะถูกมองเห็นโดยใช้ไพรเมอร์ที่มีฉลาก (กัมมันตภาพรังสีหรือฟลูออเรสเซนต์) หรือ dNTPs ดังแสดงในรูปที่ 02.
รูปที่ 02: Sanger Sequencing
ความแตกต่างระหว่าง Maxam Gilbert และ Sanger Sequencing
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Maxam Gilbert sequencing เป็นเทคนิคแรกที่พัฒนาขึ้นสำหรับการจัดลำดับ DNA | วิธีการจัดลำดับ Sanger ถูกนำมาใช้หลังจากวิธีการจัดลำดับ Maxam Gilbert |
| การใช้งาน | |
| วิธีนี้ไม่ค่อยได้ใช้ | การเรียงลำดับ Sanger ใช้สำหรับการจัดลำดับเป็นประจำ |
| การใช้สารเคมีอันตราย | |
| มันใช้สารเคมีอันตราย | การใช้สารเคมีอันตรายมีจำกัดเมื่อเทียบกับวิธี Maxam Gilbert |
| การติดฉลากสำหรับการตรวจจับ | |
| วิธีนี้ใช้กัมมันตภาพรังสี P32 สำหรับการติดฉลากส่วนปลายของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ | การเรียงลำดับ Sanger ใช้ ddNTPs ที่มีกัมมันตภาพรังสีหรือเรืองแสง |
สรุป – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert และ Sanger sequencing เป็นเทคนิคการจัดลำดับ DNA สองประเภทที่อยู่ภายใต้การจัดลำดับ DNA รุ่นแรก การจัดลำดับ Maxam Gilbert เป็นวิธีการแรกที่นำมาใช้สำหรับการจัดลำดับ DNA ในปี 1976 และดำเนินการโดยการทำลายส่วนปลายของชิ้นส่วน DNA ที่ติดฉลากด้วยสารเคมีเฉพาะพื้นฐาน ดังนั้นจึงเรียกว่าการจัดลำดับทางเคมี วิธีการจัดลำดับ Sanger ถูกนำมาใช้ในปี 1977 และอิงตามปฏิกิริยาการยุติลูกโซ่ที่ขับเคลื่อนด้วย ddNTP วิธีการจัดลำดับแซงเจอร์ที่ได้รับความนิยมมากกว่าวิธีการของแมกซ์อัม กิลเบิร์ต เนื่องจากมีข้อเสียหลายประการของวิธีการของแม็กซ์ กิลเบิร์ต เช่น การใช้เวลามากเกินไป การใช้สารเคมีอันตราย เป็นต้นนี่คือความแตกต่างระหว่างการจัดลำดับ Maxam Gilbert และ Sanger
