ความแตกต่างที่สำคัญ – การโคลนยีนกับ PCR
การสังเคราะห์ DNA หลายสำเนาจากชิ้นส่วน DNA ที่เฉพาะเจาะจงเรียกว่าการขยาย DNA กระบวนการขยาย DNA หลักมีสองขั้นตอน ได้แก่ การโคลนยีนและ PCR ความแตกต่างที่สำคัญระหว่างการโคลนยีนกับ PCR คือการโคลนยีนสร้างสำเนาหลายชุดของยีนเฉพาะในร่างกายโดยการสร้าง DNA รีคอมบิแนนท์และเติบโตภายในแบคทีเรียที่เป็นโฮสต์ ในขณะที่ PCR ผลิตสำเนาของชิ้นส่วนดีเอ็นเอเฉพาะจำนวนหลายล้านชุด ในหลอดทดลอง โดยผ่านวัฏจักรซ้ำของ การทำให้เสียสภาพและการสังเคราะห์
ยีนโคลนนิ่งคืออะไร
การโคลนยีนเป็นเทคนิคที่ใช้ในการค้นหาและเพิ่มจำนวนยีนเฉพาะจาก DNA จีโนมที่สกัดออกมาของสิ่งมีชีวิตผ่านการสร้าง DNA รีคอมบิแนนท์จีโนมดีเอ็นเอประกอบด้วยยีนต่างๆ นับพันที่เข้ารหัสโปรตีน เมื่อสกัด DNA จะรวมยีนที่เป็นไปได้ทั้งหมดที่สามารถแบกรับได้ เทคนิคการโคลนยีนทำให้สามารถตรวจจับยีนเฉพาะจาก DNA ทั้งหมดได้ ดังนั้นการโคลนยีนจึงเป็นเครื่องมือสำคัญในอณูชีววิทยา
การสร้างคลังจีโนมของสิ่งมีชีวิตเป็นสิ่งจำเป็นในการโคลนยีนหากไม่มีเบาะแสเกี่ยวกับตำแหน่งของยีนที่เกี่ยวข้องในดีเอ็นเอ ห้องสมุดจีโนมถูกสร้างขึ้นโดยใช้ขั้นตอนต่อไปนี้
ขั้นตอนที่ 1: การสกัด DNA ทั้งหมดจากสิ่งมีชีวิตที่มียีนที่ต้องการ
ขั้นตอนที่ 2: การจำกัดการย่อย DNA ที่สกัดออกมาเพื่อผลิตชิ้นส่วนขนาดเล็กที่สามารถจัดการได้ ขั้นตอนนี้อำนวยความสะดวกโดยการจำกัดเอ็นโดนิวคลีเอส
ขั้นตอนที่ 3: การเลือกเวกเตอร์ที่เหมาะสมและเปิด DNA ของเวกเตอร์โดยใช้เอนโดนิวคลีเอสที่มีข้อจำกัดเดียวกัน พลาสมิดของแบคทีเรียมักใช้เป็นพาหะนำ DNA ต่างประเทศ พลาสมิดคือ DNA วงเล็กๆ ที่อยู่ภายในแบคทีเรีย
ขั้นตอนที่ 4: การรวมเวกเตอร์ DNA และ DNA ที่แยกส่วนเพื่อผลิตโมเลกุล DNA รีคอมบิแนนท์ ขั้นตอนนี้ควบคุมโดย DNA ligase
ขั้นตอนที่ 5: การถ่ายโอนโมเลกุลดีเอ็นเอลูกผสมไปเป็นแบคทีเรียเจ้าบ้าน ขั้นตอนนี้เรียกว่าการแปลงร่างและดำเนินการโดยใช้ความร้อนช็อต
ขั้นตอนที่ 5: การคัดกรองเซลล์แบคทีเรียที่แปลงสภาพแล้วบนอาหารเลี้ยงเชื้อ ประชากรผสมของเซลล์เจ้าบ้านที่ถูกเปลี่ยนรูปและไม่แปลงรูปจะได้รับเมื่อสิ้นสุดกระบวนการแปลงสภาพ เนื่องจากยีนที่น่าสนใจมีเฉพาะในเซลล์เจ้าบ้านที่แปลงสภาพเท่านั้น ดังนั้นจึงจำเป็นต้องเลือกเซลล์ที่แปลงสภาพแล้ว การคัดเลือกจะทำโดยใช้สื่อคัดแยกที่มีสารปฏิชีวนะ เฉพาะเซลล์ที่แปลงร่างแล้วเท่านั้นที่จะเติบโตบนสื่อการคัดกรองนี้ทำให้สามารถเลือกได้
ขั้นตอนที่ 6: การเติบโตของแบคทีเรียเพื่อผลิตคลังยีน ในขั้นตอนนี้ เซลล์เจ้าบ้านที่แปลงร่างแล้วจะถูกนำมาใช้ในอาหารเลี้ยงเชื้อสดซึ่งให้ความต้องการการเจริญเติบโตที่เหมาะสม โคโลนีทั้งหมดบนจานเพาะเลี้ยงเป็นตัวแทนของคลังจีโนมของสิ่งมีชีวิตนั้น
ขั้นตอนที่ 7: โมเลกุล DNA รีคอมบิแนนท์ที่มียีนที่น่าสนใจจะต้องถูกคัดกรองจากชิ้นส่วนที่โคลนของ DNA รีคอมบิแนนท์จำนวนหลายพันชิ้น สามารถทำได้โดยการใช้โพรบที่ทำเครื่องหมายยีนจำเพาะหรือผลโปรตีนจำเพาะจากยีนนั้น
เมื่อจำแนกยีนที่สนใจซึ่งมีกลุ่มแบคทีเรียจากอาณานิคมทั้งหมดแล้ว ก็เป็นไปได้ที่จะทำสำเนาพลาสมิดรีคอมบิแนนท์ที่มียีนดังกล่าวเป็นจำนวนหลายล้านสำเนา
การโคลนนิ่งยีนใช้ในการสร้างคลังยีน ผลิตโปรตีนพิเศษ วิตามิน ยาปฏิชีวนะ ฮอร์โมน การจัดลำดับและทำแผนที่จีโนมของสิ่งมีชีวิต ทำสำเนา DNA ของบุคคลหลายชุดในนิติเวช ฯลฯ
Figure_1: การโคลนยีน
PCR คืออะไร
Polymerase Chain Reaction (PCR) เป็นเทคนิคที่สร้างสำเนาจำนวนมากของชิ้นส่วนดีเอ็นเอเฉพาะ การขยายแบบเอ็กซ์โพเนนเชียลของลำดับ DNA จำเพาะนั้นได้มาโดย PCR ภายใต้สภาวะในหลอดทดลอง เทคนิคนี้เป็นเครื่องมือที่ทรงพลังมากในอณูชีววิทยา เนื่องจากสามารถขยายตัวอย่างดีเอ็นเอจำนวนเล็กน้อยให้เป็นปริมาณที่ใช้งานได้ PCR เปิดตัวโดย Kary Mullis ในปี 1983 และสิ่งประดิษฐ์ที่ได้รับรางวัลนี้ทำให้เกิดความก้าวหน้าอย่างมากในอณูชีววิทยา
PCR ทำปฏิกิริยาตามปฏิกิริยา PCR ซ้ำๆ ดังแสดงในรูปที่ 02 ปฏิกิริยา PCR หนึ่งปฏิกิริยาประกอบด้วยสามขั้นตอนหลักที่เกิดขึ้นที่อุณหภูมิต่างกันสามระดับ การเสื่อมสภาพของเกลียวคู่ที่ DNA ที่ 94 0C การหลอมของไพรเมอร์ที่ 68 0C และการยืดเกลียวที่ 72 0 C. ดังนั้น เมื่อทำ PCR ควรรักษาความผันผวนของอุณหภูมิไว้อย่างมากเพื่อการจำลองแบบที่เหมาะสม PCR ดำเนินการในเครื่อง PCR ภายในหลอด PCR หลอด PCR บรรจุด้วย PCR ผสมที่ถูกต้องซึ่งประกอบด้วยแม่แบบ DNA, Taq polymerase, ไพรเมอร์, dNTP และบัฟเฟอร์การเปลี่ยนสภาพของ DNA ตัวอย่างสายคู่ให้เป็น DNA สายเดี่ยวทำได้โดยการทำลายพันธะไฮโดรเจนระหว่างเบสคู่สมที่ 94 – 98 0C จากนั้น DNA แม่แบบเส้นเดียวก็ถูกเปิดเผยสำหรับไพรเมอร์ ควรมีไพรเมอร์คู่หนึ่ง (ไปข้างหน้าและถอยหลัง) และควรให้พวกมันทนความร้อนได้เพื่อทนต่ออุณหภูมิสูง ไพรเมอร์เป็นลำดับดีเอ็นเอสั้นแบบเกลียวเดี่ยวที่ประกอบเข้ากับส่วนปลายของชิ้นส่วนดีเอ็นเอเป้าหมาย ไพรเมอร์สังเคราะห์ใช้ใน PCR ไพรเมอร์จับกับฐานเสริมของ DNA ตัวอย่างและเริ่มการสังเคราะห์สายใหม่ ขั้นตอนนี้ถูกเร่งโดยเอนไซม์ที่เรียกว่า Taq polymerase; เอนไซม์ DNA polymerase ที่ทนความร้อนซึ่งแยกได้จาก Thermus auqaticus เมื่อมีไพรเมอร์และนิวคลีโอไทด์ (หน่วยการสร้าง) Taq polymerase จะสร้างสายใหม่ของ DNA ประกอบกับแม่แบบ DNA ในตอนท้ายของโปรแกรม PCR จะมีการสังเกตส่วนของ DNA ที่ขยายออกโดยใช้เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส หากจำเป็นต้องมีการวิเคราะห์เพิ่มเติม ผลิตภัณฑ์ PCR จะถูกทำให้บริสุทธิ์จากเจล
PCR มีประโยชน์มากสำหรับการวินิจฉัยและติดตามโรคทางพันธุกรรมและโรคที่ได้มา การระบุอาชญากร (ในด้านนิติเวช) ศึกษาโครงสร้างและหน้าที่ของกลุ่มเป้าหมายของ DNA การจัดลำดับและการทำแผนที่ของจีโนมของสิ่งมีชีวิต เป็นต้น PCR ได้กลายเป็นเทคนิคในห้องปฏิบัติการตามปกติในห้องปฏิบัติการวิจัยทางการแพทย์และอณูชีววิทยาในหมู่นักวิทยาศาสตร์เนื่องจากมีการใช้งานที่หลากหลาย
Figure_2: ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส
ยีนโคลนและ PCR ต่างกันอย่างไร
การโคลนยีนกับ PCR |
|
| การโคลนยีนเป็นกระบวนการสร้างสำเนาหลายชุดของยีนเฉพาะในร่างกายผ่าน DNA รีคอมบิแนนท์และแปรสภาพเป็นแบคทีเรียเจ้าบ้าน | เทคนิค PCR สร้างสำเนาของลำดับ DNA เฉพาะในหลอดทดลองหลายชุดผ่านวัฏจักรของปฏิกิริยา PCR ซ้ำๆ |
| ข้อกำหนดในการสร้างดีเอ็นเอลูกผสม | |
| ดีเอ็นเอลูกผสมถูกสร้างขึ้นเพื่อค้นหายีน | ไม่สร้างดีเอ็นเอลูกผสม |
| ความต้องการแรงงาน | |
| ขั้นตอนนี้ใช้แรงงานมาก | ไม่ต้องทำงานหนัก |
| ในหลอดทดลองหรือในหลอดทดลอง | |
| การสร้าง recombinant DNA อยู่ในหลอดทดลอง และการขยาย DNA นั้นอยู่ในร่างกาย | การขยาย DNA เกิดขึ้นอย่างสมบูรณ์ในหลอดทดลอง |
สรุป – การโคลนยีนเทียบกับ PCR
การโคลนยีนและ PCR เป็นสองวิธีที่ใช้สำหรับการขยาย DNA PCR เป็นกระบวนการในหลอดทดลองซึ่งทำสำเนาดีเอ็นเอของชิ้นส่วนดีเอ็นเอเฉพาะหลายชุดโดยไม่ต้องใช้ดีเอ็นเอลูกผสมและสิ่งมีชีวิตที่เป็นโฮสต์ การโคลนนิ่งยีนเป็นกระบวนการหลักในสิ่งมีชีวิต ซึ่งส่งผลให้เกิดสำเนาของยีนที่สนใจจำนวนมากภายในสิ่งมีชีวิตที่เป็นโฮสต์ผ่านการสร้าง DNA รีคอมบิแนนท์ นี่คือความแตกต่างระหว่างการโคลนยีนกับ PCR
