ความแตกต่างที่สำคัญ – ไนโตรเซลลูโลสกับ PVDF
Western blotting เป็นวิธีการตรวจจับและหาปริมาณโปรตีนจำเพาะจากตัวอย่างโปรตีน ความน่าเชื่อถือของเทคนิคขึ้นอยู่กับการเลือกเมมเบรนที่ถูกต้องสำหรับการดูดซึมโปรตีนจากเจล เมมเบรนพรุนมีหลายประเภท เยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลสและ PVDF เป็นเมมเบรนสองชนิดที่นักวิจัยต้องการเนื่องจากมีคุณสมบัติพิเศษเหนือเมมเบรนประเภทอื่น การเลือกระหว่างไนโตรเซลลูโลสหรือ PVDF ก็เป็นอีกหนึ่งความท้าทายในการซับแบบตะวันตก ทั้งไนโตรเซลลูโลสและ PVDF มีความสามารถในการดูดซับโปรตีนสูงความแตกต่างที่สำคัญระหว่างเมมเบรนไนโตรเซลลูโลสและเมมเบรน PVDF คือเมมเบรนไนโตรเซลลูโลสไม่มีความสามารถในการลอกแอนติบอดีออกและนำเมมเบรนกลับมาใช้ใหม่สำหรับการทำซ้ำของแอนติบอดีในขณะที่เยื่อ PVDF มีความสามารถในการลอกและนำกลับมาใช้ใหม่ได้
ไนโตรเซลลูโลสคืออะไร
ไนโตรเซลลูโลสเป็นพอลิเมอร์ที่ผลิตขึ้นโดยการบำบัดเซลลูโลสด้วยกรดไนตริก และใช้ทำเยื่อพรุนขนาดเล็กในทางชีววิทยาระดับโมเลกุล โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับเทคนิคการซับ เช่น การซับใต้ เหนือ และตะวันตก ขนาดรูพรุนของเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลสมีตั้งแต่ 3 ถึง 20 µm เยื่อพรุนขนาดเล็กของไนโตรเซลลูโลสช่วยในการตรวจหาปฏิกิริยาอิมมูโนเคมีที่เกิดขึ้นบนพื้นผิวของเมมเบรน ดังนั้น เยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลสจึงมักใช้สำหรับการตรึงโปรตีนและการตรวจหาโปรตีนจำเพาะในการซับแบบตะวันตก เยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลสยังสามารถตรึงไกลโคโปรตีนและกรดนิวคลีอิกได้
เยื่อไนโตรเซลลูโลสเป็นที่นิยมในการทดสอบการไหลด้านข้างเนื่องจากคุณสมบัติหลายประการเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลสดูดซับโปรตีนที่ความเข้มข้นสูง ตัวทำละลายที่ใช้ในการทำให้เมมเบรนเปียกไม่ทำให้การดูดซึมโปรตีนของเมมเบรนไนโตรเซลลูโลสลดลง เยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลสสามารถตัดขนาดเจลที่ต้องการได้อย่างง่ายดาย และถ่ายโอนโปรตีนจากเจลไปยังเมมเบรนโดยการถ่ายโอนด้วยไฟฟ้าหรือเส้นเลือดฝอย ไนโตรเซลลูโลสช่วยให้โปรตีนไหลผ่านเมมเบรนได้เร็วขึ้นและมีศักยภาพในการจับสูง ไนโตรเซลลูโลสแสดงให้เห็นถึงความแข็งแกร่งของการจัดการที่ดีขึ้น คุณสมบัติพิเศษอีกประการของเมมเบรนไนโตรเซลลูโลสคือสามารถติดกาวได้อย่างง่ายดายด้วยกาวกันน้ำที่ไม่เป็นตัวทำละลายบน backing พลาสติกต่างๆ
รูปที่ 01: เมมเบรนไนโตรเซลลูโลสสำหรับกระดาษซับแบบตะวันตก
PVDF คืออะไร
Polyvinylidene difluoride (PVDF) เป็นฟลูออโรโพลิเมอร์ที่ผลิตโดยกระบวนการโพลิเมอไรเซชันของไวนิลดีน ไดฟลูออไรด์ และมีความสามารถในการตรึงโปรตีนสูงดังนั้นเยื่อพรุนขนาดเล็กที่ทำจาก PVDF จึงถูกใช้ในเทคนิคการซับแบบตะวันตกเพื่อวิเคราะห์โปรตีนจำเพาะจากส่วนผสมของโปรตีน เมมเบรน PVDF สามารถใช้สำหรับการวิเคราะห์กรดอะมิโนและการหาลำดับโปรตีน ลักษณะที่สำคัญที่สุดของเมมเบรน PVDF เหนือเมมเบรนไนโตรเซลลูโลสคือสามารถถอดแอนติบอดีออกจากแอนติบอดีและนำกลับมาใช้ซ้ำสำหรับโพรบแอนติบอดีต่อไปได้
เยื่อหุ้ม PVDF หนากว่าเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลส จึงทนทานต่อความเสียหายระหว่างการนำกลับมาใช้ใหม่ได้มากขึ้น เมมเบรน PVDF ไม่ชอบน้ำสูง จึงต้องแช่เมทานอลหรือไอโซโพรพานอลก่อนใช้
ไนโตรเซลลูโลสกับ PVDF ต่างกันอย่างไร
ไนโตรเซลลูโลสกับ PVDF |
|
| ไนโตรเซลลูโลสเป็นโพลีเมอร์ที่ประกอบด้วยเซลลูโลส | PVDF เป็นฟลูออโรโพลิเมอร์ที่ผลิตโดยกระบวนการโพลิเมอไรเซชันของไวนิลดีน ไดฟลูออไรด์ |
| ขนาดรูพรุนของเมมเบรน | |
| ขนาดรูขุมขนทั่วไปคือ 0.1, 0.2 หรือ 0.45μ | ขนาดรูขุมขนทั่วไปคือ 0.1, 0.2 หรือ 0.45μm |
| ความสามารถในการจับโปรตีน | |
| ไนโตรเซลลูโลสมีความสามารถในการจับโปรตีน 80 ถึง 100 ไมโครกรัม/ซม.2. | PVDF มีความสามารถในการจับโปรตีน 170 ถึง 200 μg/cm2. |
| ความไว | |
| มีความไวต่ำเมื่อเทียบกับ PVDF | มีความไวสูง |
| การตรวจหาโปรตีนที่แสดงออกต่ำ | |
| เนื่องจากเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลสมีความไวต่ำ จึงไม่เหมาะสำหรับการตรวจหาโปรตีนที่แสดงออกในระดับต่ำ | เหมาะสำหรับการตรวจจับโปรตีนระดับต่ำเนื่องจากมีความไวสูง |
| เสียงพื้นหลัง | |
| มีเสียงพื้นหลังต่ำ | มีเสียงพื้นหลังสูงขึ้น |
| ปฏิสัมพันธ์กับโปรตีน | |
| โปรตีนจับกับเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลสผ่านปฏิกิริยาไม่ชอบน้ำ | โปรตีนจับกับเยื่อหุ้ม PVDF ผ่านปฏิกิริยาที่ไม่ชอบน้ำและไดโพล |
| ธรรมชาติของเมมเบรน | |
| ไนโตรเซลลูโลสเปราะและเปราะบาง อย่างไรก็ตาม ไนโตรเซลลูโลสมีเวอร์ชันต่างๆ และสามารถต้านทานได้ | PVDF มีความทนทานและทนต่อสารเคมีได้ดีกว่า |
| ความสามารถในการถอดและนำกลับมาใช้ใหม่ | |
| ไนโตรเซลลูโลสอาจมีปัญหาในการลอกและทำซ้ำโดยไม่สูญเสียสัญญาณ | PVDF เหมาะสำหรับการทำซ้ำและการเรียงลำดับแอปพลิเคชัน |
| ความเหมาะสม | |
| ไนโตรเซลลูโลสเหมาะสำหรับการตรวจหาโปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำ | PVDF เหมาะสำหรับการตรวจหาโปรตีนน้ำหนักโมเลกุลที่สูงขึ้น |
| การใช้งานอื่นๆ | |
| ไนโตรเซลลูโลสสามารถใช้สำหรับการวิเคราะห์กรดนิวคลีอิกและการซับจุด/ช่อง | PVDF สามารถใช้สำหรับการจัดลำดับโปรตีนและระบบวิเคราะห์เฟสของแข็ง |
| ต้นทุน | |
| ถูกกว่าเมมเบรน PVDF | ราคาแพงกว่าเยื่อไนโตรเซลลูโลส |
| ต้องเตรียมน้ำก่อน | |
| เยื่อไนโตรเซลลูโลสไม่ต้องแช่เมทานอลล่วงหน้า | เยื่อ PVDF ต้องแช่ด้วยเมทานอลล่วงหน้า |
สรุป – ไนโตรเซลลูโลส vs PVDF
เยื่อไนโตรเซลลูโลสเป็นเยื่อแผ่นแรกที่ใช้ในเชิงพาณิชย์สำหรับการทดสอบการไหลด้านข้าง มีความสามารถในการดูดซับโปรตีนสูง ดังนั้นเยื่อไนโตรเซลลูโลสจึงถูกนำมาใช้ในการซับแบบตะวันตก PVDF เป็นเมมเบรนอีกประเภทหนึ่งที่ใช้ในการซับแบบตะวันตกและมีความสามารถในการดูดซับโปรตีนสูง ทั้งสองประเภทถูกใช้ใน Western blotting สำหรับการวิเคราะห์โปรตีน อย่างไรก็ตาม เยื่อหุ้ม PVDF มีคุณสมบัติพิเศษมากกว่า ทำให้เหมาะสมกว่าเยื่อไนโตรเซลลูโลสสำหรับการซับแบบตะวันตก แต่เยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลสเหมาะสำหรับการตรวจหาโปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำ เยื่อ PVDF เหมาะสำหรับการตรวจหาโปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงนี่คือความแตกต่างระหว่างเมมเบรนไนโตรเซลลูโลสและ PVDF
