ความแตกต่างที่สำคัญ – หน้า SDS กับหน้าดั้งเดิม
SDS และเนทีฟเพจเป็นเทคนิคอิเล็กโตรโฟรีซิสเจลโพลีอะคริลาไมด์สองประเภทที่ใช้ในอณูชีววิทยา ความแตกต่างที่สำคัญระหว่าง SDS Page และ Native Page คือประเภทของเจลโพลีอะคริลาไมด์ที่ใช้ ในหน้า SDS จะใช้เจลที่ทำให้เสียสภาพ ดังนั้น โมเลกุลจะถูกแยกตามน้ำหนักโมเลกุลของพวกมัน ในทางตรงกันข้าม ใน Native Page จะใช้เจลที่ไม่ทำให้เกิดการเสียสภาพ ดังนั้นโมเลกุลจะถูกแยกตามขนาด ประจุ และรูปร่าง
Polyacrylamide Gel Electrophoresis (หน้า) ใช้เจลที่ทำขึ้นจากโพลีเมอร์ไรเซชันโมโนเมอร์อะคริลาไมด์กับเมทิลีน bisacrylamideพอลิอะคริลาไมด์มีความแข็งกว่าและทนความร้อนได้ดีกว่าอะกาโรส เจลโพลีอะคริลาไมด์มีขนาดรูพรุนเล็กกว่าซึ่งช่วยให้แยกโปรตีนได้อย่างมีประสิทธิภาพ การตั้งค่าเพจมีสองประเภทหลัก ได้แก่ SDS Page และ Native Page SDS Page หรือ Sodium-Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis แยกโปรตีนตามน้ำหนักโมเลกุล เจลสำหรับเปลี่ยนสภาพใช้ในหน้า SDS Native Page ใช้เจลที่ไม่ทำให้เกิดการเสียสภาพและแยกโปรตีนตามขนาด ประจุ และรูปร่าง (รูปแบบ 3 มิติ)
หน้า SDS คืออะไร
SDS Page เป็นเทคนิคอิเล็กโตรโฟเรติกที่ใช้บ่อยที่สุดในการแยกโปรตีนตามน้ำหนักโมเลกุล เจลทำโดยการเติม SDS (Sodium dodecyl sulfate) ซึ่งเป็นสารซักฟอก SDS ฟันปลอมโปรตีนเป็นโมโนเมอร์ SDS เป็นผงซักฟอกแบบประจุลบ ดังนั้นจึงเพิ่มประจุลบสุทธิให้กับโปรตีนในช่วง pH ที่กว้าง เมื่อประจุลบสุทธิถูกส่งไปยังโมเลกุลโปรตีน เนื่องจากการเปลี่ยนแปลงของประจุ โครงสร้างที่ซับซ้อนจะถูกทำลายลงเนื่องจากประจุลบ โปรตีนจะดึงดูดไปยังขั้วบวก ดังนั้นโมเลกุลที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำกว่าจะเคลื่อนที่ได้เร็วกว่าบนเมทริกซ์เจล และสามารถสังเกตได้ใกล้กับขั้วบวก ในขณะที่โปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงกว่าจะสังเกตเห็นได้ใกล้บ่อน้ำมากขึ้น
รูปที่ 01: เพจ SDS
SDS ที่จับกับสายโพลีเปปไทด์เป็นสัดส่วนกับมวลโมเลกุลสัมพัทธ์ ดังนั้น มวลโมเลกุลจึงสามารถหาได้จาก SDS Page การย้อมสีเจล SDS Page ทำได้โดยการย้อมด้วยโบรโมฟีนอลสีน้ำเงิน การประยุกต์ใช้ช่วงหน้า SDS ในขอบเขตที่ใหญ่ขึ้น โดยสามารถใช้เพื่อประเมินมวลโมเลกุลสัมพัทธ์และเพื่อกำหนดปริมาณโปรตีนสัมพัทธ์ในส่วนผสมของโปรตีน หน้า SDS ยังสามารถใช้เพื่อกำหนดการกระจายโปรตีนในส่วนผสมของโปรตีนหน้า SDS ยังใช้เพื่อทำให้บริสุทธิ์และประเมินโปรตีน มันถูกใช้เป็นขั้นตอนเบื้องต้นสำหรับการซับแบบตะวันตกและการผสมข้ามพันธุ์ ซึ่งจะใช้สำหรับการทำแผนที่และการระบุโปรตีน
Native Page คืออะไร
อิเล็กโทรโฟเรซิสเจลโพลีอะคริลาไมด์เนทีฟ (หน้าเนทีฟเพจ) ใช้เจลที่ไม่ทำให้เกิดการเสียสภาพ ดังนั้นจึงไม่เติม SDS หรือสารเปลี่ยนสภาพอื่นๆ ลงในเมทริกซ์เจล ใน Native Page การแยกโปรตีนขึ้นอยู่กับประจุและขนาดของโปรตีน ดังนั้นความคล่องตัวของโปรตีนจึงขึ้นอยู่กับประจุและขนาดของโปรตีน
ประจุของโปรตีนขึ้นอยู่กับสายโซ่ด้านข้างของกรดอะมิโน หากโซ่ด้านข้างมีประจุลบ โปรตีนจะได้รับประจุลบโดยรวมและในทางกลับกัน โปรตีนยังคงรักษารูปแบบ 3 มิติไว้เนื่องจากการพับที่เกิดขึ้น ผลจากการพับของโปรตีนหลายชนิด เช่น พันธะไดซัลไฟด์ ปฏิกิริยาที่ไม่ชอบน้ำ และพันธะไฮโดรเจนดังนั้น หากพาหน้าดั้งเดิมถูกพาไปที่ pH เป็นกลาง โปรตีนจะถูกแยกออกตามรูปร่างโมเลกุลของโปรตีน ดังนั้น Native Page จึงสามารถใช้เป็นเทคนิคที่ละเอียดอ่อนในการตรวจจับการเปลี่ยนแปลงของประจุหรือโครงสร้างของโปรตีนได้
ข้อดีหลักของหน้าดั้งเดิมคือโปรตีนที่ใช้สำหรับการวิเคราะห์หน้าสามารถกู้คืนได้ในสถานะเดิมหลังจากการวิเคราะห์หน้า เนื่องจากโปรตีนจะไม่ถูกรบกวนระหว่างกระบวนการ Native Page เป็นเทคนิคปริมาณงานที่ค่อนข้างสูงและความเสถียรของโปรตีนก็เพิ่มขึ้น
รูปที่ 02: เพจดั้งเดิม
เมื่อใช้งานเจลเสร็จแล้ว สามารถดู Native Page gel ได้โดยการย้อมด้วยโบรโมฟีนอลบลูหรือน้ำยาย้อมสีอื่นๆ ที่เหมาะสม การใช้งานของ Native Page รวมถึงการแยกโปรตีนที่เป็นกรด ซึ่งรวมถึงไกลโคโปรตีน เช่น รีคอมบิแนนท์ erythropoietin ของมนุษย์ หรือการระบุโปรตีนที่มีอยู่ใน Bovine Serum Albumin (BSA)
อะไรคือความคล้ายคลึงกันระหว่างหน้า SDS และหน้าดั้งเดิม
- ทั้งระบบ SDS Page และ Native Page ใช้เจลโพลีอะคริลาไมด์เป็นเมทริกซ์ของเจล
- ทั้งสองใช้สำหรับแยกและระบุโปรตีน
- ทั้งสองใช้การเคลื่อนที่แบบอิเล็กโตรโฟเรติกเพื่อแยกสารประกอบ
- สามารถทำได้ทั้งสองแบบในแนวตั้งหรือแนวนอน (ส่วนใหญ่เป็นการตั้งค่าหน้าแนวตั้งเนื่องจากความยาวมากกว่า)
- อุปกรณ์อิเล็กโตรโฟรีซิสรวมทั้งถังเจล หวี แหล่งจ่ายไฟจำเป็นสำหรับการทำงานของทั้งสองเทคนิค
- การลงสีเจลทำได้ทั้งสองวิธี
หน้า SDS และหน้าเนทีฟต่างกันอย่างไร
หน้า SDS เทียบกับหน้าดั้งเดิม |
|
| หน้า SDS หรือหน้าโซเดียม-โดเดซิลซัลเฟตแยกโปรตีนตามน้ำหนักโมเลกุลของพวกมัน และใช้เจลที่ทำให้เสียสภาพ | เนทีฟเพจใช้เจลที่ไม่ทำให้เกิดการเสียสภาพและแยกโปรตีนตามขนาด ประจุ และรูปร่าง (รูปแบบ 3 มิติ) |
| ประเภทเจล | |
| ใช้เจลแปลงสภาพใน SDS-page | ใช้เจลที่ไม่ทำให้เกิดการเสียสภาพในเนทีฟเพจ |
| การปรากฏตัวของ SDS | |
| SDS มีอยู่ในสารซักฟอกเพื่อให้ประจุลบบนตัวอย่างในหน้า SDS | SDS ไม่มีอยู่ในเพจดั้งเดิม |
| พื้นฐานการแยก | |
| การแยกโปรตีนขึ้นอยู่กับน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนในหน้า SDS | การแยกขึ้นอยู่กับขนาดและรูปร่างของโมเลกุลโปรตีนในหน้าดั้งเดิม |
| ความเสถียรของโปรตีน | |
| ความเสถียรของโปรตีนต่ำในหน้า SDS | ความเสถียรของโปรตีนสูงในเพจดั้งเดิม |
| ฟื้นฟูโปรตีนดั้งเดิม | |
| เป็นไปไม่ได้เพราะถูกทำให้เสียสภาพในหน้า SDS | เป็นไปได้ในเพจดั้งเดิม |
สรุป – หน้า SDS เทียบกับหน้าดั้งเดิม
SDS Page และ Native Page เป็นเทคนิค Polyacrylamide gel electrophoresis สองประเภทที่ใช้ในการแยกโปรตีน SDS Page ได้รับการบำบัดด้วยผงซักฟอกที่เรียกว่า SDS SDS ให้ประจุลบโดยรวมแก่โปรตีน ซึ่งส่งผลให้เกิดการเสียสภาพของโปรตีนดังนั้นโปรตีนจะถูกแยกออกตามน้ำหนักโมเลกุล ในทางตรงกันข้าม เทคนิค Native Page ไม่ได้ใช้สารทำให้เสียสภาพ ดังนั้นโปรตีนจะถูกแยกออกตามขนาดหรือรูปร่าง นี่คือความแตกต่างระหว่างหน้า SDS และหน้าดั้งเดิม
