ความแตกต่างที่สำคัญ – RT PCR กับ QPCR
ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสเป็นเทคนิคที่ใช้ในการขยายขอบเขตเฉพาะของ DNA ในหลอดทดลอง เนื่องจากการประดิษฐ์เทคนิคนี้โดย Kary Mullis ในปี 1983 นักวิทยาศาสตร์สามารถสร้างชิ้นส่วน DNA ที่เฉพาะเจาะจงได้หลายพันถึงล้านสำเนาเพื่อวัตถุประสงค์ในการวิจัย ปัจจุบันได้กลายเป็นเทคนิคที่ใช้กันทั่วไปและดำเนินการเป็นประจำในห้องปฏิบัติการทางคลินิกและการวิจัยเพื่อการใช้งานที่หลากหลาย เทคนิค PCR แบบดั้งเดิมมีหลายรูปแบบ เช่น RT PCR, nested PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT – QPCR เป็นต้น RT PCR และ Q PCR เป็น PCR รูปแบบที่สำคัญสองรูปแบบ ความแตกต่างที่สำคัญระหว่าง RT PCR และ Q PCR คือ RT PCR ใช้เพื่อตรวจจับการแสดงออกของยีนผ่านการสร้างการถอดรหัส DNA (cDNA) จาก RNA ในขณะที่ Q PCR ใช้เพื่อวัดปริมาณผลิตภัณฑ์ PCR แบบเรียลไทม์โดยใช้สีย้อมเรืองแสง
RT PCR คืออะไร
ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสการถอดรหัสแบบย้อนกลับ (RT PCR) เป็นตัวแปรของ PCR ซึ่งใช้ในการตรวจจับการแสดงออกของอาร์เอ็นเอ เป็นวิธีที่สำคัญมากในการตรวจหาการแสดงออกของ mRNA ในเนื้อเยื่อ RT PCR ถูกใช้เมื่อสารตั้งต้นของตัวอย่างคือ RNA ใน RT PCR เทมเพลต mRNA จะถูกแปลงเป็น DNA เสริมก่อน ขั้นตอนนี้ถูกเร่งโดยเอนไซม์ reverse transcriptase และกระบวนการนี้เรียกว่าการถอดรหัสแบบย้อนกลับ ประการที่สอง มีการใช้ PCR แบบดั้งเดิมสำหรับ cDNA ที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่สำหรับการขยายสัญญาณ
RT PCR เป็นเทคนิคที่มีความไวสูงซึ่งต้องใช้ตัวอย่าง RNA ในปริมาณที่ค่อนข้างน้อย RT PCR มักใช้ในการวินิจฉัยและการหาปริมาณของสปีชีส์อาร์เอ็นเอ โดยเฉพาะไวรัสอาร์เอ็นเอ เช่น ไวรัสภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์ และไวรัสตับอักเสบซี
รูปที่ 01: RT PCR Technique
QPCR คืออะไร
PCR เชิงปริมาณ (QPCR) เป็นตัวแปรของ PCR ที่ใช้ในการวัดผลิตภัณฑ์ PCR ในเชิงปริมาณ นอกจากนี้ยังเรียกว่าปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์ เนื่องจากจะวัดการขยายตามเวลาจริงโดยใช้เครื่อง PCR แบบเรียลไทม์ เป็นวิธีการที่เหมาะสมสำหรับการกำหนดปริมาณของลำดับเป้าหมายหรือยีนที่มีอยู่ในตัวอย่าง คุณลักษณะที่น่าสนใจของ QPCR คือการรวมทั้งการขยายเสียงและการหาปริมาณที่แท้จริงไว้ในขั้นตอนเดียว ดังนั้นความต้องการเจลอิเล็กโตรโฟรีซิสในการตรวจจับจึงสามารถกำจัดได้ด้วยเทคนิค QPCR QPCR ใช้สีย้อมเรืองแสงเพื่อติดฉลากผลิตภัณฑ์ PCR ระหว่างปฏิกิริยา PCR ซึ่งในที่สุดจะนำไปสู่การหาปริมาณโดยตรง เมื่อผลิตภัณฑ์ PCR สะสม สัญญาณฟลูออเรสเซนต์ก็จะถูกสะสมด้วยและจะวัดด้วยเครื่องเรียลไทม์ QPCR สามารถใช้ร่วมกับ RT PCR ได้ เป็นที่รู้จักกันในชื่อ RT – QPCR หรือ QRT – PCR และถือเป็นวิธีการที่มีประสิทธิภาพ ละเอียดอ่อน และเชิงปริมาณมากที่สุดสำหรับการตรวจหาระดับ RNA ในเซลล์หรือเนื้อเยื่อ
SYBR Green และ Taqman เป็นสองวิธีที่ใช้ในการตรวจจับหรือดูกระบวนการขยายสัญญาณของ PCR แบบเรียลไทม์ วิธี SYBR Green ดำเนินการโดยใช้สีย้อมเรืองแสงที่เรียกว่า SYBR green และตรวจจับการขยายสัญญาณโดยการผูกมัดย้อมเพื่อผลิต DNA ที่มีเกลียวคู่ Taqman ดำเนินการโดยใช้โพรบที่มีฉลากคู่และตรวจจับการขยายสัญญาณโดยการย่อยสลายโพรบโดย Taq polymerase และการปล่อยฟลูออโรฟอร์ดังแสดงในรูปที่ 02 ทั้งสองวิธีติดตามความคืบหน้าของกระบวนการขยายสัญญาณและรายงานปริมาณของผลิตภัณฑ์แบบเรียลไทม์.
PCR แบบเรียลไทม์มีการใช้งานที่หลากหลาย เช่น การหาปริมาณการแสดงออกของยีน, การวิเคราะห์ microRNA และการวิเคราะห์ RNA แบบไม่เข้ารหัส, จีโนไทป์ SNP, การตรวจจับตัวแปรหมายเลขสำเนา, การตรวจหาการกลายพันธุ์ที่หายาก, การตรวจหาสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม, การตรวจหาเชื้อ, เป็นต้น
รูปที่ 02: เทคนิค PCR เชิงปริมาณ
ความแตกต่างระหว่าง RT PCR และ QPCR คืออะไร
RT PCR เทียบกับ QPCR |
|
| RT PCR เป็นเทคนิคที่ใช้ในการตรวจจับการแสดงออกของยีนโดยการขยายสัญญาณ | QPCR เป็นเทคนิคที่ขยาย DNA และหาปริมาณผลิตภัณฑ์ PCR แบบเรียลไทม์ |
| การมีส่วนร่วมของเอนไซม์ Reverse Transcriptase | |
| เอนไซม์ reverse transcriptase ใช้สำหรับ RT PCR | เอนไซม์ reverse transcriptase ไม่ได้ใช้สำหรับ QPCR |
| การใช้โมเลกุลที่ติดฉลากเรืองแสง | |
| สีย้อมหรือโพรบที่ติดฉลากเรืองแสงไม่ได้ใช้สำหรับ RT PCR | สีย้อมหรือโพรบที่ติดฉลากเรืองแสงใช้สำหรับ QPCR |
| ปริมาณของผลิตภัณฑ์ PCR | |
| เว้นแต่ควบคู่ไปกับ QPCR RT PCR จะไม่นับจำนวนผลิตภัณฑ์ PCR | QPCR วัดผลิตภัณฑ์ PCR ในเชิงปริมาณ |
| วัสดุเริ่มต้น | |
| วัสดุเริ่มต้นคือ mRNA | สารตั้งต้นคือ DNA |
| การสังเคราะห์ cDNA | |
| สร้าง DNA เสริมระหว่าง RT PCR | ไม่มีการสร้าง DNA เสริมระหว่าง QPCR |
สรุป – RT PCR กับ QPCR
RT PCR และ QPCR เป็น PCR ดั้งเดิมสองเวอร์ชัน เทคนิค RT PCR ดำเนินการสำหรับตัวอย่าง mRNA และขับเคลื่อนโดยการถอดรหัสแบบย้อนกลับและการผลิต cDNAQPCR ใช้ในการหาปริมาณผลิตภัณฑ์ PCR ในระหว่างรอบความร้อน PCR แบบเรียลไทม์โดยใช้สีย้อมเรืองแสงหรือหัววัดที่ติดฉลาก ใน QPCR ปริมาณของผลิตภัณฑ์ PCR จะแสดงด้วยสัญญาณเรืองแสงที่ปล่อยออกมาจากตัวอย่าง RT PCR นิยมใช้เป็นกระบวนการขยายสัญญาณ ในขณะที่ QPCR มักใช้เป็นกระบวนการหาปริมาณ นี่คือข้อแตกต่างระหว่าง RT PCR และ QPCR
