ความแตกต่างที่สำคัญ – Blunt vs Sticky End Ligation
จำกัดเอ็นโดนิวคลีเอสคือเอ็นไซม์จำเพาะที่ตัด DNA แบบสองสาย (dsDNA) พวกเขายังเป็นที่รู้จักกันในนามกรรไกรโมเลกุลในอณูชีววิทยา เอ็นไซม์การจำกัดสามารถจดจำลำดับสั้น ๆ ที่เฉพาะเจาะจงของ dsDNA ที่รู้จักกันในชื่อตำแหน่งการจดจำและแยกพันธะฟอสโฟไดสเตอร์และพันธะไฮโดรเจนเพื่อเปิดสายคู่ อันเป็นผลมาจากการแตกแยกโดยเอนไซม์เหล่านี้ ชิ้นส่วนดีเอ็นเอถูกผลิตขึ้นด้วยปลายประเภทต่างๆ เช่น ปลายเหนียวและปลายทู่ DNA ligase เป็นเอ็นไซม์ที่ใช้ในอณูชีววิทยาเพื่อเชื่อม DNA สองเส้นที่อยู่ติดกันโดยสร้างพันธะใหม่ขั้นตอนนี้เรียกว่า ligation และตามประเภทของ ligation ที่ปลาย DNA สามารถเรียกได้ว่าเป็น blunt end ligation และ ligation สิ้นสุดแบบเหนียว ความแตกต่างที่สำคัญระหว่าง ligation ปลายทู่และปลายเหนียวคือ ligation ปลายทู่เกิดขึ้นระหว่างชิ้นส่วนดีเอ็นเอซึ่งมีปลายทู่สองอัน ในขณะที่ลิเกชั่นปลายแบบเหนียวจะเกิดขึ้นระหว่างระยะยื่น 5' และ 3' เมื่อเปรียบเทียบกับ blunt end ligation แล้ว ligation ที่ปลายแบบเหนียวจะมีประสิทธิภาพและเสถียรมากกว่า
Blunt End Ligation คืออะไร
เอ็นโดนิวคลีเอสที่มีข้อจำกัดบางอย่างสามารถตัดดีเอ็นเอที่เบสตรงข้ามและผลิตชิ้นส่วนดีเอ็นเอปลายทู่ได้ เอนไซม์เหล่านี้เรียกว่าเครื่องตัดปลายทู่ พวกมันตัดตรงลงไปตรงกลางของพื้นที่จำกัดโดยไม่ทิ้งฐานที่ยื่นออกมาเป็นเกลียวเดียว ปลายทื่อเรียกอีกอย่างว่าปลายไม่ยื่นเนื่องจากไม่มีฐานยื่น 3 และ 5 ที่ปลาย ทั้งสองเส้นสิ้นสุดจากคู่เบสที่ปลายทู่ เอ็นไซม์ตัดปลายทู่ทั่วไปคือ EcoRV HaeIII, AluI และ SmaI
ligation ปลายทื่อมีส่วนเกี่ยวข้องระหว่างปลายทู่ทั้งสองข้าง ไม่ใช่การผูกฐานของฐานที่ยื่นออกมา ligation นี้มีประสิทธิภาพน้อยกว่า ligation ที่ปลายเหนียว อย่างไรก็ตาม ในบางกรณี blunt end ligation จะมีประโยชน์มากกว่า ligation end ligation โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อทำการผูกผลิตภัณฑ์ PCR ผลิตภัณฑ์ PCR ผลิตด้วยปลายทู่เสมอ ligation ปลายทู่ไม่ต้องการส่วนปลายเสริมใน DNA สำหรับ ligation
รูปที่ 01: Blunt end production โดย Eco RV enzyme
Sticky End Ligation คืออะไร
เอ็นโดนิวคลีเอสที่มีข้อจำกัดบางอย่างสามารถตัด dsDNA ทิ้งได้ โดยเหลือชิ้นส่วนของ DNA สายเดี่ยวที่ยื่นออกมาในตอนท้าย ปลายเหล่านี้เรียกว่าปลายเหนียวหรือยื่นออกมา ลิเกชั่นปลายแบบเหนียวเกิดขึ้นระหว่างชิ้นส่วนดีเอ็นเอสองชิ้นซึ่งมีส่วนยื่นที่เข้าคู่กัน เนื่องจากปลายที่เหนียวมีเบสที่ไม่มีการจับคู่และต้องการเบสเสริมเพื่อสร้างพันธะดังนั้นจึงจำเป็นต้องใช้เอ็นไซม์จำกัดเดียวกันสำหรับแหล่งที่มาของ DNA ทั้งสองแหล่งเพื่อผลิตชิ้นส่วน ligating ที่เข้าคู่กัน
ligation ปลายแบบเหนียวมีประสิทธิภาพมากกว่าและเป็นที่ต้องการอย่างมากในกระบวนการโคลนนิ่ง มีเอ็นไซม์จำกัดหลายตัวที่สร้างปลายเหนียว ได้แก่ EcoRI, BamHI, HindIII เป็นต้น
รูปที่ 02: Sticky end production โดย Eco RI enzyme
Blunt และ Sticky End Ligation ต่างกันอย่างไร
Blunt vs Sticky End Ligation |
|
| ลิเกชั่นปลายทู่เกิดขึ้นระหว่างชิ้นส่วนดีเอ็นเอปลายทู่สองชิ้น | ligation ปลายเหนียวเกิดขึ้นระหว่างชิ้นส่วน DNA ที่ตรงกันสองชิ้นที่มีปลายเหนียว |
| เอ็นไซม์ | |
| ใบมีดทื่อผลิตปลายทื่อ | หัวกัดเหนียวทำให้เกิดปลายเหนียวหรือเหนียว |
| ข้อกำหนดของการจับคู่สิ้นสุด | |
| มันไม่ต้องการชิ้นส่วนที่ตรงกันหรือฐานเสริม | ต้องใช้ฐานเสริมที่ส่วนท้ายเพื่อสร้างคู่เบส |
| ประสิทธิภาพ | |
| มีประสิทธิภาพน้อยกว่าการผูกมัดปลายเหนียว | มีประสิทธิภาพมากกว่ามัดปลายทู่ |
สรุป – Blunt vs Sticky End Ligation
จำกัดเอ็นโดนิวคลีเอสสามารถผ่า dsDNA และสร้างชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีปลายต่างกันได้พวกเขารู้จักลำดับเฉพาะและจำกัด DNA ที่สร้างปลายที่เหนียวและทู่ ปลายเหนียวมีฐานที่ไม่ได้จับคู่ที่ส่วนท้ายของชิ้นส่วน ปลายทื่อถูกสร้างขึ้นเนื่องจากความแตกแยกตรงและมีฐานคู่ที่ปลาย ligation ปลายเหนียวต้องใช้ DNA สายเดี่ยวเสริมสองชิ้น ligation ปลายทู่เกิดขึ้นระหว่างชิ้นส่วนปลายทู่สองชิ้น นี่คือข้อแตกต่างระหว่าง ligation ทื่อและเหนียว
