ความแตกต่างที่สำคัญ – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green และ Taqman เป็นสองวิธีที่ใช้ในการตรวจจับหรือดูกระบวนการขยายสัญญาณของ PCR แบบเรียลไทม์ SYBR Green เป็นวิธีการที่ใช้สีย้อมกรดนิวคลีอิกแบบอินเทอร์คาเลต ในขณะที่ Taqman เป็นวิธีที่ใช้โพรบไฮโดรไลซิส เทคโนโลยีทั้งสองได้รับการออกแบบมาเพื่อสร้างการเรืองแสงในระหว่าง PCR ซึ่งช่วยให้เครื่อง PCR แบบเรียลไทม์สามารถตรวจสอบปฏิกิริยาใน "เรียลไทม์" วิธี SYBR Green ดำเนินการโดยใช้สีย้อมเรืองแสงที่เรียกว่า SYBR green และตรวจจับการขยายสัญญาณโดยการผูกมัดย้อมเพื่อผลิต DNA ที่มีเกลียวคู่ Taqman ดำเนินการโดยใช้โพรบสองฉลากและตรวจจับการขยายสัญญาณโดยการย่อยสลายโพรบโดย Taq polymerase และการปล่อยฟลูออโรฟอร์นี่คือข้อแตกต่างที่สำคัญระหว่าง SYBR Green และ Taqman
สีเขียว SYBR คืออะไร
SYBR สีเขียวเป็นสีย้อมเรืองแสงที่ใช้ย้อมกรดนิวคลีอิก โดยเฉพาะอย่างยิ่ง DNA แบบสองเกลียวในอณูชีววิทยา วิธี SYBR Green ใช้ในการหาปริมาณผลิตภัณฑ์ PCR ระหว่าง PCR แบบเรียลไทม์ เมื่อมันจับกับ DNA แล้ว DNA-dye complex ที่ได้จะดูดซับแสงสีน้ำเงินและปล่อยแสงสีเขียวที่เข้มข้น มันเกิดขึ้นเนื่องจากการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่เกิดขึ้นในโมเลกุลของสีย้อมเมื่อจับกับ DNA ที่มีเกลียวคู่ เมื่อ PCR สร้าง DNA มากขึ้นเรื่อย ๆ โมเลกุลของสีย้อมจะจับกับ DNA มากขึ้นทำให้เกิดการเรืองแสงมากขึ้น ดังนั้นการเรืองแสงจะเพิ่มขึ้นตามการสะสมผลิตภัณฑ์ PCR ดังนั้น ปริมาณของผลิตภัณฑ์ PCR สามารถวัดได้ในเชิงปริมาณโดยการตรวจจับการเรืองแสงสีเขียว SYBR
สีย้อมสีเขียว SYBR สามารถใช้สำหรับการติดฉลาก DNA ใน cytometry และกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง Ethidium bromide ถูกแทนที่ด้วย SYBR Green ได้สำเร็จ เนื่องจาก Ethidium bromide เป็นสีย้อมสารก่อมะเร็งที่มีปัญหาในการกำจัดระหว่างการสร้างภาพ DNA ในเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส
วิธีสีเขียว SYBR มีทั้งข้อดีและข้อเสีย วิธีนี้มีความละเอียดอ่อนมาก ราคาไม่แพง และใช้งานง่าย อย่างไรก็ตาม เนื่องจากความสามารถในการผูกมัดกับ DNA ที่มีเกลียวคู่ การผูกมัดแบบไม่เฉพาะเจาะจงอาจนำไปสู่การหาปริมาณของผลิตภัณฑ์ PCR ที่มากเกินไป
รูปที่ 01: SYBR Green Technique
Taqman คืออะไร
Taqman เป็นวิธีการทางเลือกสำหรับ SYBR Green ในการตรวจสอบกระบวนการ PCR แบบเรียลไทม์ วิธีนี้ขึ้นอยู่กับกิจกรรม exonuclease 5' - 3' ของเอนไซม์ Taq polymerase ในการย่อยสลายโพรบในระหว่างการขยายของเกลียวใหม่และการปล่อยฟลูออโรฟอร์ วิธีนี้ใช้โพรบสองฉลากและอิงจากการไฮโดรไลซิสของโพรบ โพรบคือโอลิโกนิวคลีโอไทด์ของ DNA ที่ติดฉลากเรืองแสงซึ่งมีโมเลกุลรีพอร์ตเตอร์เรืองแสง (ฟลูออโรฟอร์) ที่ปลาย 5’ และโมเลกุลดับเชอร์ที่ปลาย 3’ออกแบบมาเพื่อผูกมัดกับแม่แบบที่เป็นเกลียวเดี่ยวที่ด้านตรงข้ามของการอบอ่อนของสีรองพื้น Taq polymerase จะเพิ่มนิวคลีโอไทด์ให้กับไพรเมอร์และขยายเกลียวใหม่ไปยังโพรบที่มีฉลากคู่ เมื่อ Taq polymerase พบกับโพรบ การกระทำ exonuclease ของ Taq polymerase จะกระตุ้นและทำให้โพรบเสื่อม เมื่อมันเสร็จสิ้นการสังเคราะห์ของเกลียวใหม่ โพรบจะถูกย่อยสลายอย่างสมบูรณ์และปล่อยฟลูออโรฟอร์ การปล่อยฟลูออโรฟอร์ทำให้เกิดการเรืองแสง โมเลกุล Quencher เรืองแสงช่วยดับแสงที่ปล่อยออกมาอย่างมีประสิทธิภาพและสร้างเอาต์พุตสำหรับการหาปริมาณของผลิตภัณฑ์ PCR การปล่อยฟลูออโรฟอร์และปริมาณของผลิตภัณฑ์ PCR เป็นสัดส่วนกัน ดังนั้น การหาปริมาณสามารถทำได้ง่ายโดยวิธี Taqman
รูปที่ 02: วิธี Taqman
วิธี Taqman ใช้ใน PCR แบบเรียลไทม์ การหาปริมาณการแสดงออกของยีน การตรวจหาความหลากหลายทางพันธุกรรม การหาปริมาณของการลบดีเอ็นเอของโครโมโซม การระบุแบคทีเรีย การตรวจสอบการวิเคราะห์ไมโครอาร์เรย์ จีโนไทป์ SNP เป็นต้น
สีเขียว SYBR กับ Taqman ต่างกันอย่างไร
SYBR กรีน vs แทคมัน |
|
| SYBR สีเขียวขึ้นอยู่กับสีย้อมพันธะดีเอ็นเอ | Taqman ขึ้นอยู่กับโพรบไฮบริไดเซชันและกิจกรรม exonuclease 5' ถึง 3' ของ Taq polymerase |
| หลอดวัดเรืองแสง | |
| ไม่จำเป็นต้องใช้โพรบที่ติดฉลากเรืองแสง | ต้องใช้โพรบสองป้าย |
| การวิเคราะห์ยีนมัลติเพล็กซ์ | |
| ไม่สามารถใช้กับเป้าหมายของยีนมัลติเพล็กซ์ | ใช้สำหรับเป้าหมายของยีนมัลติเพล็กซ์ |
| ต้นทุน | |
| นี้ถูกลง | แพงกว่านี้ |
| เฉพาะ | |
| มีความเฉพาะเจาะจงน้อยกว่าและผูกมัดกับ DNA สายคู่ใดๆ | สิ่งเหล่านี้มีความเฉพาะเจาะจงมากเนื่องจากโพรบตรวจพบผลิตภัณฑ์ขยายสัญญาณเฉพาะ |
| ประสิทธิผล | |
| สิ่งนี้ไม่มีประสิทธิภาพ | นี่ได้ผลมาก |
| แอปพลิเคชัน | |
| ใช้ใน PCR แบบเรียลไทม์, การสร้างภาพเจล agarose, การติดฉลาก DNA ฯลฯ | ใช้ใน PCR แบบเรียลไทม์ การหาปริมาณการแสดงออกของยีน การตรวจหาความหลากหลายทางพันธุกรรม ฯลฯ |
สรุป – SYBR Green และ Taqman
Taqman และ SYBR green เป็นสองวิธีที่ใช้ใน PCR แบบเรียลไทม์ (PCR เชิงปริมาณ) ทั้งสองวิธีช่วยให้สามารถหาปริมาณของผลิตภัณฑ์ PCR ได้อย่างมีประสิทธิภาพและอาศัยการปล่อยแสงเรืองแสง วิธี Taqman ใช้โพรบสองฉลากเพื่อตรวจหา DNA ที่สะสม ในขณะที่วิธี SYBR Green ใช้สีย้อมเรืองแสง ทั้งสองวิธีนี้มีการใช้งานที่แตกต่างกันในอณูชีววิทยา
