ความแตกต่างที่สำคัญ – ซับเหนือ vs ใต้ vs ตะวันตก
การตรวจจับลำดับเฉพาะของ DNA, RNA และโปรตีนเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการศึกษาประเภทต่างๆ ทางอณูชีววิทยา เจลอิเล็กโตรโฟรีซิสเป็นเทคนิคที่แยก DNA, RNA และโปรตีนตามขนาด จากโปรไฟล์เจล ลำดับ DNA เฉพาะ ลำดับอาร์เอ็นเอ หรือโปรตีนจะถูกตรวจพบโดยเทคนิคพิเศษที่เรียกว่า blotting และ hybridization ด้วยโพรบที่ติดฉลากไว้ วิธีการซับมี 3 วิธี คือ ทางใต้ ทางเหนือ และทางตะวันตก ความแตกต่างที่สำคัญระหว่างการซับซับแบบเหนือและแบบตะวันตกนั้นขึ้นอยู่กับประเภทของโมเลกุลที่ตรวจพบจากตัวอย่างSouthern blotting เป็นวิธีการตรวจหาลำดับดีเอ็นเอจำเพาะจากตัวอย่างดีเอ็นเอ Northern blotting เป็นเทคนิคที่ตรวจจับลำดับ RNA เฉพาะจากตัวอย่าง RNA Western blotting เป็นวิธีการตรวจหาโปรตีนจำเพาะจากตัวอย่างโปรตีน
Southern Blotting คืออะไร
เทคนิคการซับแบบใต้ได้รับการพัฒนาโดย E. M. Southern ในปี 1975 เพื่อระบุลำดับดีเอ็นเอจำเพาะจากตัวอย่างดีเอ็นเอ นี่เป็นเทคนิคแรกที่นำมาใช้ในอณูชีววิทยา ช่วยให้สามารถตรวจจับยีนที่จำเพาะจาก DNA ชิ้นส่วนจำเพาะจาก DNA เป็นต้น เทคนิค Southern blotting มีหลายขั้นตอน มีดังนี้
- DNA ถูกแยกออกจากตัวอย่างและย่อยด้วยเอ็นโดนิวคลีเอสที่มีข้อจำกัด
- ตัวอย่างที่ย่อยแล้วคั่นด้วย Agarose gel electrophoresis
- DNA แฟรกเมนต์ในเจลถูกทำให้เสียสภาพเป็นเส้นเดียวโดยใช้สารละลายอัลคาไลน์
- DNA สายเดี่ยวถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรนกรองไนโตรเซลลูโลสโดยการถ่ายโอนเส้นเลือดฝอย
- DNA ที่ถ่ายโอนถูกตรึงบนเมมเบรนอย่างถาวร
- DNA ที่ถูกตรึงบนเยื่อหุ้มเซลล์ถูกผสมด้วยหัววัดที่ติดฉลาก
- DNA ที่ไม่ถูกผูกมัดจะถูกชะล้างออกจากเยื่อหุ้มเซลล์ด้วยการซัก
- ฟิล์ม X-ray สัมผัสกับเมมเบรนและเตรียม autoradiograph
Southern blotting ถูกนำไปใช้ในด้านต่างๆ ของอณูชีววิทยา มีประโยชน์ในการทำแผนที่ RFLP, การศึกษาทางนิติเวช, DNA methylation ในการแสดงออกของยีน, การตรวจหายีนที่กลายพันธุ์ในความผิดปกติทางพันธุกรรม, ลายนิ้วมือ DNA, ฯลฯ
รูปที่ 01: เทคนิคการซับใต้
Northern Blotting คืออะไร
ซับเหนือเป็นวิธีที่ออกแบบมาเพื่อตรวจจับลำดับอาร์เอ็นเอเฉพาะหรือลำดับ mRNA จากตัวอย่างเพื่อศึกษาการแสดงออกของยีน เทคนิคนี้ได้รับการพัฒนาโดย Alwine, Kemp และ Stark ในปี 1979 เทคนิคนี้แตกต่างจากเทคนิคการซับแบบ Southern และ Western เนื่องจากมีขั้นตอนหลายขั้นตอน อย่างไรก็ตาม เทคนิคนี้ยังดำเนินการผ่านเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส ซับซับ และไฮบริไดเซชันด้วยโพรบและการตรวจจับที่ติดฉลากเฉพาะ เทคนิคการซับเหนือทำได้ดังนี้
- RNA ถูกสกัดจากตัวอย่างและคั่นด้วยเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส
- RNA ถูกถ่ายโอนจากเจลไปยังเยื่อกระดาษซับและแก้ไข
- เมมเบรนได้รับการรักษาด้วยโพรบติดฉลากที่เตรียมจาก cDNA หรือ RNA (โพรบเป็นส่วนเสริมของลำดับเฉพาะในตัวอย่าง)
- โพรบถูกฟักด้วยเมมเบรนเพื่อผูกเป็นลำดับเฉพาะ
- ถอดสายวัดออก
- autoradiograph ตรวจพบชิ้นส่วนไฮบริด
การซับเหนือเป็นเครื่องมือสำคัญในการตรวจหาและหาปริมาณของ mRNA แบบผสม, ศึกษาการย่อยสลายของ RNA, การประเมินค่าครึ่งชีวิต RNA, การตรวจจับการประกบ RNA, การศึกษาการแสดงออกของยีน ฯลฯ
รูปที่ 02: ซับเหนือ
Western Blotting คืออะไร
Western blotting เป็นวิธีการตรวจหาโปรตีนจำเพาะจากส่วนผสมโปรตีนโดยใช้แอนติบอดีที่มีฉลากกำกับไว้ ดังนั้น Western blot จึงเรียกว่า immunoblot เทคนิคนี้ถูกนำมาใช้โดย Towbin et al ในปี 1979 และขณะนี้ได้มีการดำเนินการเป็นประจำในห้องปฏิบัติการเพื่อการวิเคราะห์โปรตีน มีขั้นตอนดังนี้
- โปรตีนสกัดจากตัวอย่าง
- โปรตีนแบ่งตามขนาดโดยใช้โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส
- โมเลกุลที่แยกจากกันจะถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF หรือเมมเบรนไนโตรเซลลูโลสโดยอิเล็กโตรโพเรชัน
- เมมเบรนถูกปิดกั้นสำหรับการจับกับแอนติบอดีที่ไม่เฉพาะเจาะจง
- โปรตีนที่ถ่ายโอนจับกับแอนติบอดีปฐมภูมิ (แอนติบอดีที่ติดฉลากด้วยเอนไซม์)
- ล้างเมมเบรนเพื่อกำจัดแอนติบอดีปฐมภูมิที่จับไม่จำเพาะ
- แอนติบอดีที่ถูกผูกมัดถูกตรวจพบโดยการเพิ่มสารตั้งต้นและตรวจจับตะกอนสีที่เกิดขึ้น
Western blotting มีประโยชน์ในการตรวจหาแอนติบอดีต้าน HIV ในตัวอย่างซีรัมของมนุษย์ Western blot ยังสามารถใช้เป็นแบบทดสอบยืนยันการติดเชื้อไวรัสตับอักเสบบีและการทดสอบขั้นสุดท้ายสำหรับโรควัวบ้า
รูปที่ 03: Western Blotting
ซับเหนือและตะวันตกแตกต่างกันอย่างไร
ซับเหนือ vs ใต้ vs ตะวันตก |
|
| ประเภทของโมเลกุลที่ตรวจพบ | |
| ซับเหนือ | กระดาษซับทางเหนือตรวจพบลำดับ RNA เฉพาะจากตัวอย่าง RNA |
| ซับใต้ | Southern blotting ตรวจจับลำดับ DNA จากตัวอย่าง DNA |
| เวสเทิร์นบล็อต | Western blotting ตรวจจับโปรตีนจำเพาะจากตัวอย่างโปรตีน |
| ประเภทเจล | |
| ซับเหนือ | นี่ใช้เจลอากาโรส/ฟอร์มาลดีไฮด์ |
| ซับใต้ | ใช้เจล Agarose |
| เวสเทิร์นบล็อต | ใช้เจลโพลีอะคริลาไมด์ |
| วิธีซับ | |
| ซับเหนือ | นี่คือการถ่ายโอนเส้นเลือดฝอย |
| ซับใต้ | นี่คือการถ่ายโอนเส้นเลือดฝอย |
| เวสเทิร์นบล็อต | นี่คือการโอนทางไฟฟ้า |
| โพรบที่ใช้ | |
| ซับเหนือ | cDNA หรือโพรบอาร์เอ็นเอติดฉลากกัมมันตภาพรังสีหรือไม่มีกัมมันตภาพรังสี |
| ซับใต้ | DNA โพรบติดฉลากกัมมันตภาพรังสีหรือไม่มีกัมมันตภาพรังสี |
| เวสเทิร์นบล็อต | แอนติบอดีปฐมภูมิใช้เป็นโพรบ |
| ระบบตรวจจับ | |
| ซับเหนือ | ทำได้โดยใช้ autoradiograph หรือการตรวจจับแสงหรือการเปลี่ยนสี |
| ซับใต้ | ทำได้โดยใช้ autoradiograph การตรวจจับแสงหรือการเปลี่ยนสี |
| เวสเทิร์นบล็อต | ทำได้โดยใช้การตรวจจับแสงหรือการเปลี่ยนสี |
สรุป – ซับเหนือ vs ใต้ vs ตะวันตก
Blotting เป็นเทคนิคพิเศษที่พัฒนาขึ้นเพื่อระบุ DNA, RNA หรือโปรตีนจำเพาะจากตัวอย่างมีขั้นตอนการซับซับแยกกันสามขั้นตอน คือ ทางเหนือ ทางใต้ และทางตะวันตก เพื่อตรวจหาโมเลกุลชนิดใดชนิดหนึ่งโดยเฉพาะ เทคนิคการซับเหนือถูกออกแบบมาเพื่อตรวจจับลำดับอาร์เอ็นเอเฉพาะจากส่วนผสมของอาร์เอ็นเอ เทคนิค Southern blotting ช่วยให้สามารถตรวจจับลำดับ DNA จำเพาะจากตัวอย่าง DNA และเทคนิค Western blotting ได้รับการพัฒนาเพื่อระบุโปรตีนจำเพาะจากส่วนผสมของโปรตีน