ข้อแตกต่างที่สำคัญระหว่าง Golden Gate และ Gibson Assembly คือ Golden Gate อาศัยการมีอยู่ของไซต์จำกัดภายในลำดับเฉพาะที่จะโคลนได้ ในขณะที่ Gibson Assembly ไม่ได้อาศัยการมีอยู่ของไซต์ข้อจำกัดภายในลำดับเฉพาะ ถูกโคลน
ในช่วงหลายทศวรรษที่ผ่านมา นักวิทยาศาสตร์ระดับโมเลกุลได้พัฒนาขั้นตอนมาตรฐานต่างๆ ที่ช่วยให้ประกอบชิ้นส่วนดีเอ็นเอหลายชิ้นเป็นชิ้นเดียวได้ง่ายขึ้น ดังนั้นวิธีการโคลนนิ่ง เช่น Restriction Enzyme Ligation, Gateway Cloning, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly และ TOPO Cloning ถูกใช้อย่างกว้างขวางโดยนักวิจัยในการทดลองทางวิทยาศาสตร์ดังนั้น Golden Gate และ Gibson Assembly จึงเป็นวิธีการโคลนโมเลกุลสองวิธีที่ช่วยให้สามารถประกอบชิ้นส่วน DNA หลายชิ้นเป็นชิ้นเดียวได้
Golden Gate Assembly คืออะไร
โกลเด้นเกทเป็นวิธีการโคลนโมเลกุลที่อำนวยความสะดวกในการประกอบชิ้นส่วนดีเอ็นเอหลายชิ้นเป็นชิ้นเดียว วิธีการนี้อาศัยการมีอยู่ของไซต์การจำกัดภายในลำดับเฉพาะที่จะโคลน มันเกิดขึ้นในปี 1996 เทคนิคนี้ใช้เอนไซม์จำกัด Type IIS และ T4 DNA ligase เอ็นไซม์เหล่านี้ตัด DNA ออกนอกบริเวณที่รับรู้ สามารถสร้างส่วนที่ยื่นแบบ non-palindromic ดังนั้น DNA หลายๆ ชิ้นจึงสามารถประกอบเข้าด้วยกันได้โดยใช้ลำดับที่ยื่นออกมา
รูปที่ 01: Golden Gate
ขั้นตอนการประกอบประตูทอง
เทคนิคประตูทองมีสามขั้นตอนหลักในกระบวนการ:
- การสร้างส่วนยื่นในเวกเตอร์โคลน
- การประกอบ DNA หลายอันโดยใช้ลำดับเฉพาะชิ้นส่วนในโอเวอร์แฮงก์ และ
- ligation
Golden Gate assembly ใช้เวกเตอร์โคลนแบบวงกลม (เวกเตอร์ปลายทาง) นอกจากนี้ ในวิธีนี้ ไซต์การจำกัดจะถูกลบออกจากผลิตภัณฑ์ผูกมัดเพื่อดำเนินการย่อยอาหารและ ligation พร้อมกัน โปรโตคอลวงจรความร้อนโดยทั่วไปสำหรับ Golden Gate จะแกว่งไปมาระหว่าง 37 °C ถึง 16 °C เนื่องจาก 37 °C เหมาะสมที่สุดสำหรับเอ็นไซม์จำกัด และ 16 °C เหมาะสมที่สุดสำหรับไลกาส
Gibson Assembly คืออะไร
Gibson Assembly เป็นวิธีการโคลนโมเลกุลที่ช่วยให้ประกอบชิ้นส่วนดีเอ็นเอหลายชิ้นเป็นชิ้นเดียว วิธีนี้ไม่เหมือนกับวิธี Golden Gate ตรงที่ไม่ต้องอาศัยการมีอยู่ของไซต์ที่มีข้อจำกัดภายในลำดับเฉพาะในการโคลนมันถูกค้นพบโดย Daniel G. Gibson จาก J. Craig Venter Institute เทคนิคนี้เป็นประเภทของลำดับและวิธีการโคลนนิ่งอิสระ (SLIC)
รูปที่ 02: Gibson Assembly
ขั้นตอนประกอบกิ๊บสัน
กิ๊บสันแอสเซมบลีต้องการชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีคู่เบส 20-40 คู่ซ้อนทับกับชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่อยู่ติดกัน เพิ่มการทับซ้อนผ่าน PCR จากนั้นชิ้นส่วนดีเอ็นเอเหล่านี้จะถูกเพิ่มลงในส่วนผสมของ Gibson maser ที่มีสามเอนไซม์ ขั้นตอนนี้ดำเนินการภายใต้สภาวะอุณหภูมิความร้อน (50 °C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง) โดยใช้เอนไซม์ที่แตกต่างกันสามชนิด: exonuclease, DNA polymerase และ DNA ligase exonuclease เคี้ยว DNA กลับจากปลาย 5' ดังนั้นจึงไม่ยับยั้งการทำงานของพอลิเมอเรสและปล่อยให้ปฏิกิริยาดำเนินไปในกระบวนการเดียวบริเวณที่เป็นเส้นเดี่ยวที่เป็นผลลัพธ์บนชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่อยู่ติดกันสามารถหลอมได้เนื่องจากลำดับที่ทับซ้อนกัน DNA polymerase เติมช่องว่างโดยการเพิ่มนิวคลีโอไทด์ ในที่สุด DNA ligase จะเข้าร่วมกับ DNA ของส่วนที่อยู่ติดกันอย่างโควาเลนต์ โดยปกติ Gibson Assembly จะใช้เวกเตอร์ปลายทางที่เป็นเส้นตรง นอกจากนี้ วิธีนี้ยังสามารถรวมชิ้นส่วน DNA ได้มากถึง 15 ชิ้นตามความคล้ายคลึงของลำดับ
ความเหมือนระหว่าง Golden Gate กับ Gibson Assembly
- Golden Gate และ Gibson Assembly เป็นวิธีการโคลนโมเลกุลสองวิธี
- ทั้งสองวิธีสามารถประกอบชิ้นส่วนดีเอ็นเอหลายชิ้นเป็นชิ้นเดียวได้
- วิธีการเหล่านี้ใช้เวกเตอร์ปลายทาง
- ทั้งสองวิธีใช้ประโยชน์จากวงจรความร้อนเพื่อประกอบชิ้นส่วน DNA หลายชิ้น
- ใช้ในไซต์ที่ก่อให้เกิดการกลายพันธุ์
ความแตกต่างระหว่าง Golden Gate และ Gibson Assembly
โกลเดนเกตเป็นวิธีการโคลนโมเลกุลที่ใช้ในการประกอบชิ้นส่วนดีเอ็นเอหลายชิ้นเป็นชิ้นเดียวโดยอาศัยการมีอยู่ของไซต์จำกัดภายในลำดับเฉพาะที่จะทำการโคลน ขณะที่ Gibson Assembly เป็นวิธีการโคลนโมเลกุลที่ใช้ใน การประกอบชิ้นส่วน DNA หลายชิ้นเป็นชิ้นเดียวโดยไม่ต้องอาศัยการมีอยู่ของตำแหน่งการจำกัดภายในลำดับเฉพาะที่จะทำการโคลนนี่คือข้อแตกต่างที่สำคัญระหว่าง Golden Gate และ Gibson Assembly นอกจากนี้ วิธี Golden Gate ยังใช้เวกเตอร์ปลายทางแบบวงกลม ในขณะที่วิธี Gibson Assembly ใช้เวกเตอร์ปลายทางที่เป็นเส้นตรง
อินโฟกราฟิกต่อไปนี้แสดงความแตกต่างระหว่าง Golden Gate และ Gibson Assembly
สรุป – Golden Gate vs Gibson Assembly
การโคลนโมเลกุลเป็นวิธีการที่ใช้ในการประกอบโมเลกุลดีเอ็นเอลูกผสมและควบคุมการจำลองแบบภายในสิ่งมีชีวิตที่เป็นโฮสต์ Golden Gate และ Gibson Assembly เป็นวิธีการโคลนโมเลกุลสองวิธีที่ช่วยให้สามารถประกอบชิ้นส่วนดีเอ็นเอหลายชิ้นเป็นชิ้นเดียวได้ วิธีการของ Golden Gate อาศัยการมีอยู่ของไซต์การจำกัดภายในลำดับเฉพาะที่จะทำการโคลน ในขณะที่ Gibson Assembly ไม่ได้อาศัยการมีอยู่ของไซต์การจำกัดภายในลำดับเฉพาะที่จะทำการโคลน ดังนั้น นี่คือข้อแตกต่างที่สำคัญระหว่าง Golden Gate และ Gibson Assembly
